小球藻-不动杆菌-假单胞菌联合去除养殖废水氮、磷方法
申请日期：2018.08.24
公佈（公告）日期：2018.12.25
IPC 分类编号 C02F3/32；C02F3/34；C12N1/20；C12N1/12；C12R1/89；C12R1/01；C12R1/38；/20
概括
本发明公开了一种小球藻、不动杆菌和假单胞菌联合去除养殖废水中氮和磷的方法，本发明利用小球藻分离培养伴生的不动杆菌和假单胞菌，将小球藻、不动杆菌和假单胞菌联合去除养殖废水中的氮和磷，本发明将小球藻、不动杆菌和假单胞菌联合使用，达到协同效应，可显著去除养殖废水中的氮和磷，具有良好的应用前景和市场价值。
索赔
1.一种小球藻、不动杆菌和假单胞菌联合去除养殖废水中氮和磷的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)获得初次培养物：取10-20L养殖废水，通过粗滤、离心去除悬浮物及较大的浮游生物，然后过滤获得滤液，收集滤膜上的沉淀物，转入M0液体培养基，在25℃、全天光照、摇床转速100下培养2-3天，获得小球藻-不动杆菌的初次培养物；
(2)小球藻的分离、培养与强化：取小球藻-不动杆菌初培养物，稀释、离心，将所得沉淀接种于M0固体培养基中，分离、转接，即得小球藻菌株；将小球藻菌株接种于M1液体强化培养基中，在25℃全天光照条件下培养2～3天，再转接于新的M1液体强化培养基中培养，再重复培养2周，即得强化小球藻；
(3)获得伴生不动杆菌：取小球藻-不动杆菌初培养物，离心，加入M2液体培养基，在25℃、无光条件下继续扩大培养3～4天，离心去上清，换入等体积的新鲜的M1液体强化培养基，获得不动杆菌初培养物；定期测定培养液中磷含量，当磷去除率达到60％以上时，取培养液离心，将所得沉淀转移至M0固体培养基中培养分离，获得小球藻伴生不动杆菌；
(4)获得伴生假单胞菌：取步骤(2)所述的强化小球藻，置于500ml～1L M0液体培养基中，全天光照、25℃培养3～5天，然后取出5～10ml液体，离心加入M3液体培养基中，继续在25℃、无光照条件下扩大培养3～6天，离心去上清，换入等体积的新鲜M3液体培养基，采用低溶氧培养法，定时测定培养基中的氮、磷含量，当氮去除率达到75％以上、磷去除率达到60％以上时，取培养基离心，将所得沉淀转移至M3固体培养基中培养分离，即得伴生小球藻假单胞菌；
(5)将步骤(2)中强化小球藻、步骤(3)中获得的不动杆菌、步骤(4)中获得的假单胞菌混合，放入养殖废水中，让其自然生长3～7天，即可完成养殖废水中氮、磷的去除；
其中，每升M0液体培养基包括以下组分：NaNO3，0.04mg、MgSO4·7H2O 75mg、CaCl2·2H2O 36mg、柠檬酸6mg、EDTA，1mg，20mg；
每升M0固体培养基包括以下组分：NaNO3 0.04mg、75mg、CaCl2·2H2O 36mg、柠檬酸6mg、EDTA 1mg、20mg、琼脂粉2wt%；
每升M1液体强化培养基含有以下成分：NaNO3，0.05mg，柠檬酸6mg；
M2液体培养基每升含有以下成分：4g、30mg、NH4Cl 60mg、CaCl2·2H2O 17.2mg，pH 7.0；
M3液体培养基每升包括以下组分：NH4Cl 0.3g、CaCl2.2H2O 30mg、100mg、0.5mg、0.2g，pH 7.0至7.5；
每升M3固体培养基包括以下组分：0.3g、30mg、NH4Cl 60mg、CaCl2.2H2O 0.5mg、蛋白胨16g、明胶冻18.0g，pH为7.0～7.5。
2.根据权利要求1所述的小球藻、不动杆菌和假单胞菌联合去除养殖废水中氮和磷的方法，其特征在于，步骤（1）中，小球藻菌株也可以通过购买获得；当小球藻菌株为购买时，在进行步骤（1）之前，先将购买的小球藻菌株投入养殖废水中，然后再进行后续步骤。
3.根据权利要求1或2所述的小球藻、不动杆菌和假单胞菌联合去除养殖废水中氮和磷的方法，其特征在于，步骤（5）中强化小球藻：不动杆菌：假单胞菌的体积比为100～200：1：1。
4.根据权利要求3所述的小球藻、不动杆菌和假单胞菌联合去除养殖废水中氮和磷的方法，其特征在于：混合的小球藻、不动杆菌和假单胞菌的接种体积与养殖废水的体积比为1:1:500-1000。
手动的
一种小球藻-不动杆菌-假单胞菌联合去除养殖废水中氮磷的方法
技术领域
本发明属于水产养殖废水处理技术和环境保护技术领域，具体涉及一种小球藻、不动杆菌和假单胞菌联合去除水产养殖废水中氮、磷的方法。
背景技术
目前，我国水污染问题日益严重，氨氮、总氮、有机物及新型有毒污染物层出不穷。国家新“水十条”中对沿海地级以上城市实施总氮排放控制要求，对水处理的要求上升到了更高的层次，因此人们对氨氮、磷、总氮等污染的处理进行了广泛的研究。水产养殖废水的氮磷污染更为严重，畜禽废水大量排入当地水系，影响严重。我国每年产生水禽粪便约1亿吨，广州每天排放畜禽废水500多万吨，严重破坏水体生态平衡。特别是畜禽废水具有COD高、可生化性强、氮磷含量高等特点； 另外废水产生量与养殖模式、畜禽品种、养殖量等密切相关，规模化养猪场废水排放量大且集中，其废水还具有冲击负荷大、冲厕时污水排放量大、其他时间水量小等特点。传统采用的回田模式、生态处理模式均存在各自的问题，无法推广。传统的微生物脱氮除磷技术系统投资大、运行费用高，亟待寻找一种低成本、高效的畜禽废水处理新方法。基于养殖业的现状及升级要求，亟待寻找一种低成本、高效的畜禽废水处理新方法。
一般而言，微生物脱氮是一种比较经济的手段，尤其在水产养殖和水禽养殖领域。脱氮过程包括氨氧化、硝化、反硝化和厌氧氨氧化，如何将几种微生物稳定地组合起来也是脱氮的一个难点。除磷也是通过微生物对体内磷的超量积累，然后在生物体被清除后再去除。传统的生物技术和物化技术去除一方面需要消耗能量，另一方面需要进一步保持微生物的活性和深度处理才能完成氮磷元素的高效去除。微藻水处理技术是近年来新兴的资源净化技术。微藻是一类能够吸收水体中大量氮磷元素的小型藻类，有些种类在一定条件下还能代谢有机碳源，从而实现碳、氮、磷污染物的去除。 因此，将微藻应用于水禽\水产养殖废水处理，一方面可以实现高效去除磷、氮营养物，从而避免水体的富营养化；另一方面，通过对藻类进行回收利用，完善水体，将其转化为更常用的饵料等营养产品，产生潜在的经济效益。然而，藻类生长速度相对较慢，对水产养殖废水中一些较复杂的有机物和有机氮的利用能力有限。因此，需要采取额外的措施来增强含有大量有机物的水产养殖废水的处理效率。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中养殖废水中氮、磷去除效果差的问题，提供一种能够显著提高养殖废水中氮、磷去除效率的方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了一种小球藻-不动杆菌-假单胞菌联合去除养殖废水中氮和磷的方法，包括以下步骤：
(1)获得初次培养物：取10-20L养殖废水，通过粗滤、离心去除悬浮物及较大的浮游生物，然后过滤获得滤液，收集滤膜上的沉淀物，转入M0液体培养基，在25℃、全天光照、摇床转速100下培养2-3天，获得小球藻-不动杆菌的初次培养物；
(2)小球藻的分离、培养与强化：取小球藻-不动杆菌初培养物，稀释、离心，将所得沉淀接种于M0固体培养基中，分离、转接，即得小球藻菌株；将小球藻菌株接种于M1液体强化培养基中，在25℃全天光照条件下培养2～3天，再转接于新的M1液体强化培养基中培养，再重复培养2周，即得强化小球藻；
(3)获得伴生不动杆菌：取小球藻-不动杆菌初培养物，离心，加入M2液体培养基，在25℃、无光条件下继续扩大培养3～4天，离心去上清，换入等体积的新鲜的M1液体强化培养基，获得不动杆菌初培养物；定期测定培养液中磷含量，当磷去除率达到60％以上时，取培养液离心，将所得沉淀转移至M0固体培养基中培养分离，获得小球藻伴生不动杆菌；
(4)获得伴生假单胞菌：取步骤(2)所述的强化小球藻，置于500ml～1L M0液体培养基中，全天光照、25℃培养3～5天，然后取出5～10ml液体，离心加入M3液体培养基中，继续在25℃、无光照条件下扩大培养3～6天，离心去上清，换入等体积的新鲜M3液体培养基，采用低溶氧培养法，定时测定培养基中氮、磷含量，当氮去除率达到75％以上、磷去除率达到60％以上时，取培养基离心，将所得沉淀转移至M3固体培养基中培养分离，即得伴生小球藻假单胞菌；
(5)将步骤(2)中强化小球藻、步骤(3)中获得的不动杆菌、步骤(4)中获得的假单胞菌混合，放入养殖废水中，让其自然生长3～7天，即可完成养殖废水中氮、磷的去除；
其中，每升M0液体培养基包括以下组分：NaNO3，0.04mg、MgSO4·7H2O 75mg、CaCl2·2H2O 36mg、柠檬酸6mg、EDTA，1mg，20mg；
每升M0固体培养基包括以下组分：NaNO3 0.04mg，、CaCl2·2H2O 36mg，柠檬酸6mg，EDTA 1mg，20mg，琼脂粉2wt%；
每升M1液体强化培养基含有以下成分：NaNO3，0.05mg，柠檬酸6mg；
M2液体培养基每升含有以下成分：4g、30mg、NH4Cl 60mg、CaCl2·2H2O 17.2mg，pH 7.0；
每升M3液体培养基包括以下成分：0.3g，30mg，，CaCl2.2H2O 0.5mg，0.2g，pH 7.0至7.5；
每升M3固体培养基含有以下成分：0.3g白蛋白、30mg钙、0..2H2O、16g蛋白胨、18.0g明胶冻，pH为7.0～7.5。
作为上述小球藻-不动杆菌-假单胞菌联合去除养殖废水中氮磷的方法的优选技术方案，在步骤（1）中，小球藻菌株也可以是购买的；当购买小球藻菌株时，在进行步骤（1）之前，先将购买的小球藻菌株加入养殖废水中，然后再进行后续步骤。
作为本发明的小球藻、不动杆菌和假单胞菌联合去除养殖废水中氮磷的方法的优选技术方案，步骤(5)中强化小球藻：不动杆菌：假单胞菌的体积比为100～200：1：1。
作为本发明的小球藻与假单胞菌联合去除养殖废水中氮磷的方法的优选技术方案，所述混合的小球藻-不动杆菌-假单胞菌的接种体积与养殖废水的体积比为1:1:500～1000。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的发明人在实验中发现，小球藻与假单胞菌在特定的培养条件下形成共生状态，能够显著稳定地去除废水中的总氮、总磷。因此，本发明利用从水产养殖废水中分离的不动杆菌和假单胞菌，经过驯化培养后可用于强化小球藻处理水产养殖废水。其原理是不动杆菌和假单胞菌常与小球藻共生，其中不动杆菌是传统的好氧除磷菌。二者在与小球藻结合的过程中，通过氧气、碳源、氮源交换等互助作用，提高异养藻类对水产养殖废水中高分子有机物、难降解有机物转化能力，加速藻类对营养元素的转化能力； 假单胞菌具有反硝化和聚磷酸盐功能，在好氧条件下可完成有机物的降解，在缺氧条件下完成反硝化和聚磷酸盐的功能，二者与小球藻结合，形成藻类微环境互助体系，对小球藻废水处理效率的提升和实际应用大有裨益，具有良好的应用前景和市场价值。