师法自然！多级酶联反应登上Nature Chemistry！
制药行业是一个不断增长的行业，2020 年全球市场规模超过 1 万亿美元，是 20 年前的三倍。同样，药物发现、开发和生产的成本也在不断上升，但投资回报率往往很低。此外，公众对制药行业更环保、低浪费战略的关注和监管压力也在增加。所有这些因素共同推动了创新战略的研究，以创造更便宜、更环保、更少浪费的药品生产途径。在这种背景下，生物催化已成为克服这些障碍并实现制药行业可持续发展的有吸引力的替代方案。
酶级联是一种环保且经济高效的药物合成工艺，因为它们将不同的生物转化结合成连续反应来合成产品。这些生物催化工具可以解决制药行业的两个关键参数：提高合成反应的选择性，并通过使用生物相容性催化剂减少潜在危害，这些催化剂可以从可生物降解且通常无毒的可持续来源制备。
瑞士伯尔尼大学的团队在此概述了体内（全细胞）或体外（纯化酶）使用的各种酶级联，这些酶级联专门针对药物相关分子，从简单的构建块到复杂的药物。研究人员还通过一系列报告的实例讨论了多级酶级联及其与化学催化剂结合的优势和要求。最后，他们研究了酶级联的效率以及如何通过酶工程、流动反应器中的工艺强化和酶固定化进一步改进酶级联以满足所有工业要求。
酶级联反应：
细胞代谢所必需的生化反应通常由协同工作的酶进行。受自然界的启发，酶级联通过将多个催化步骤组合在一个反应罐中来生产各种化学产品，为单步反应提供了一种省时、经济高效的替代方案。
酶级联具有独特的优势，可以用于多步反应：
l 酶促反应由于具有共同的生物来源，其反应条件通常兼容性更强，有利于反应步骤之间的转换；
l 反应中不稳定因素的挑战大大降低；
l 巧妙的反应装置设计，可驱动酶促反应的完成；
l 由于酶的特异性很高，特别是对其天然底物的特异性，所以副反应很少。
酶级联反应的类型：
酶级联可根据不同的标准进行分类：
l 涉及反应环境：全细胞（体内）或纯化的酶（体外）。
1. 体内级联反应成本较低，但细胞膜可能成为底物或产物通量的障碍，从而阻碍催化反应。此外，产物回收困难、潜在的竞争性代谢反应和某些中间体的毒性可能会阻碍体内级联的使用。
2.体外级联可以解决大多数问题，虽然酶的纯化会增加整个过程的成本。
酶级联反应还可以根据参与反应的酶的数量进行分类：
1. 单酶级联依靠一种表现出两种活性的酶将底物转化为产物。
2. 多酶级联含有两种或两种以上的酶，可催化不同类型的反应，可分为五大类：线性、平行、正交、循环和三角。
图 | 酶级联反应的分类
化学酶级联：
天然酶级联通过进化适应了其生物条件，而这些条件通常与工业要求不同。通过结合基因工程酶或替代催化剂的人工级联可以克服这些限制。通常，化学酶级联使用有机金属复合物和酶的组合。然而，在药物合成的情况下，必须谨慎选择人工（化学）酶级联。由于药物是供人类消费的，因此对最终产品纯度的要求非常严格，污染物（即试剂和催化剂）必须低于检测水平。
药物构建模块的生物催化途径：
多年来，药物构件的生产一直是生物催化剂的主要应用之一。药物构件是用于构建潜在或已知药物的分子片段。所生产的构件不仅限于用于已知药物的下游合成，它们还使工业界能够通过组合药物发现探索新的化学空间。
l 利用转氨酶合成手性胺：转氨酶（EC 2.6.1）是一类催化氨基转移到氨基受体的酶，将前手性前体（酮）或醛转化为胺，这是许多药物中普遍存在的基序。这些酶在手性胺的合成中具有重大优势（立体选择性好、条件温和、避免使用有毒试剂和减少浪费）。O' 等人于 2014 年报道了从二酮开始合成手性 2,5-二取代吡咯烷，利用转氨酶（）和单胺氧化酶（MAO-N）的互补立体选择性，最终用硼氢化钠还原。 在此级联中，初始二酮首先被胺化以生成中间体，该中间体在水中自发环化，从而使相应的吡咯烷被 MAO-N 脱乙酰化。该酶促途径用于合成各种 2-甲基-5-苯基吡咯烷，这是抗病毒药物（即）和生物碱（即 (–)-）中的重要基序。在其他线性级联中，Zhang 等人最近报道，在全细胞转氨之前包括三个额外的酶促步骤，这使得苯乙烯烯烃转化为对映体纯的芳基二醇，从而参与紫杉醇的生产。
图 | 参与 TA 药物构件合成的酶级联反应
l 用于合成手性醇的氧化还原酶：氧化还原酶 (EC 1) 广泛用于合成手性药物结构单元。具体而言，重点是使用羰基还原酶（也称为酮还原酶 (KR) 或 ADH）合成手性醇。这些酶的主要缺点之一是对辅因子的依赖。KR 和 ADH 通常需要化学计量的 NADH 或 NADPH 来实现底物的完全转化。或者，可以组装酶级联以通过与第二种酶（葡萄糖脱氢酶 (GDH)、甲酸脱氢酶或亚磷酸脱氢酶）氧化偶联或通过添加由相同生物催化剂（乙醇或异丙醇）氧化的牺牲底物来回收此类辅因子。Lonza 的开创性工作很早就证明了这些酶用于工业相关转化的潜力。 其中一个例子是生产 (R)-乙基 4,4,4-三氟-3-羟基丁酸酯，它是抗抑郁药贝氟沙星的组成部分。
l 扩展氧化还原工具：直到最近，氧化还原酶的工业应用实际上仅限于使用羰基还原酶。随着 2011 年发现亚胺还原酶 (IRED) 及其对对映选择性 C=N 键还原的潜力，这种情况已不再存在。然而，IRED 的底物范围有限，酶不稳定性是一个挑战。随着对活性位点和催化作用的进一步了解，蛋白质工程已应用于此类酶以扩大其底物范围。在最近的一个例子中，一种新的 IRED 标记的 HeP5C（来自 的吡咯-5-羧酸还原酶）被用于制备 l-哌啶酸 (l-PA)，这是多种抗癌、抗菌和麻醉剂的关键成分。 HeP5C 与嗜热地杆菌 (GbST) 的赖氨酸脱氢酶偶联，该酶能够在 ε 位脱去 l-赖氨酸的氨，形成平行级联。在另一个例子中，Zhang 等人筛选了多个 IRED，以形成大量受阻手性 2-芳基取代吡咯烷，它们是用于治疗抑郁和焦虑的 k-阿片受体拮抗剂的前体，也可作为拉罗曲肽等抗癌药物的构建块。在这种情况下，IRED 必须与辅因子循环系统 (GDH) 偶联。
l 在水中合成单酰化二胺：一种正交方法用于辅因子再生。等人最近通过截短羧酸还原酶 (CAR) 介导的单酰化合成了不同的酰胺 17。由于该反应依赖于 ATP，这会影响该策略在制备规模上的应用，因此作者引入了辅因子回收系统。可以制备多种单乙酰二酰胺，用于生产 1-肉桂酰哌嗪（镇痛分子和血管扩张剂的前体）以及（1-（1-苯并呋喃-2-基羰基）哌嗪）。然而，大多数描述的反应需要新的策略来实现更高的底物负载并缩短反应时间，这仍然是实际限制。
图 | 用于合成药物构件的平行酶级联
简单药物的全合成：
对于药物的全合成，工业需求明确决定了工艺的适用性。为了适用，工艺必须高效以补偿初始投资的高成本，其特异性和生产率必须与市场规模相符。
l 通过酶促单策略获得对映体苯丙醇胺：苯丙醇胺属于苯丙胺家族，具有多种用途，既可作为构建块，也可作为直接应用的 API。多年来，人们一直致力于通过简单的反应装置获得此类药物，但对映体产品的合成通常需要基于昂贵的起始材料和中间体分离的多步路线。为了克服这些问题，该小组提出了两种基于酶促级联反应的主要策略来合成所有四种非（伪）麻黄碱 (N(P)E) 立体异构体。
l 用于 API 合成的水解酶：化学酶水解酶 (EC3) 无疑是工业上应用最广泛的酶类。脂肪酶尤其受欢迎，因为它们具有对映选择性、高活性和药物耐受性，以及能够通过介质选择调整其催化性能；例如，它们有利于在水溶液中水解，但在纯有机溶剂中实现相反的活性。
图 | 用于合成简单药物的酶级联反应
苯并呋喃衍生物的化学酶合成：
在化学酶级联中，铜（II）双（吡唑基）甲烷复合物与细胞色素 P450 酶偶联，合成双（2-取代苯并呋喃）衍生物。由于化学反应温度高（120°C），该级联必须分两步进行，第一步后加入酶，但无需纯化中间体，因为酶可以耐受第一步化学催化中使用的共溶剂（二甲基亚砜）。
l 酶级联生成四氢异喹啉：含四氢异喹啉（THIQ）的分子具有抗肿瘤、抗寄生虫和神经活性。过去，合成是通过发酵或典型的化学合成实现的，这导致产品产量低或涉及多步合成且特异性低。最近，报道了一种使用纯化酶的三步酶级联反应。首先，利用来自大肠杆菌的碳连接酶，以丙酮酸和3-羟基苯甲醛作为低成本底物。然后，来自紫罗兰的TA产生随后的氨基醇。最后，来自紫罗兰的正月桂酸合酶生成1,3,4-三取代的THIQ。
l 用于合成核苷类似物的多步酶级联：核苷类似物是治疗癌症和病毒性疾病的重要药物。近年来，已报道了许多以核苷磷酸化酶（EC 2.4 和 EC 2.7.7）、脱氧核糖基转移酶（EC 2.4.2.6）和脱氧核糖核苷激酶（EC 2.7.1）为主的酶级联，用于以天然核苷作为糖供体、以修饰碱基作为糖受体来合成核苷类似物。此外，还描述了使用具有四个酶促步骤的平行级联来合成同样具有药用价值的核苷酸，其中辅因子在级联中循环利用。默克公司开发了一种用于合成抗病毒核苷类似物的全酶级联的杰出例子。 在本研究中，从小分子开始，经过 5 个多酶步骤制备。级联中使用的 5 种酶（加上 4 种辅助酶，用于循环辅因子并转移不利平衡）经过定向进化，以提高对非天然底物的活性。
图 | (化学)酶法合成复杂药物
工艺强化：
在工业过程中实施多步酶级联在生物催化剂稳定性、与反应条件（即 pH、温度和共溶剂）的兼容性以及高底物浓度方面面临着不可否认的挑战。为了更贴近工业需求，可以采用不同的策略来提高酶活性和整体合成过程。
图 | 通过酶级联改进药物合成以实现工业规模整合的策略
l 工艺工程中的新技术：尽管酶促反应在工业规模上实现显著产量方面存在自身的障碍，但几种化学酶促方法已进入制药领域。在最近的一个例子中，诺华公司报告了在 XI 因子抑制剂 82 的合成中使用 KR 催化步骤。这个例子结合了不同的方法来高效合成复杂的分子，并说明了生物催化不仅可以帮助减少获得最终产品所需的步骤数，而且流动化学和表面活性剂化学可以规避实施阶段遇到的问题。
l 通过酶进化满足工业要求：如前所述，氧化还原酶在手性砌块的合成中应用广泛，但它们往往存在底物负载或所需反应条件下稳定性的不足。这些挑战可以通过蛋白质工程和进化来解决。等人最近定制了一个双酶级联反应，将KR和IRED偶联，合成了LSD1抑制剂的前体。通过初步筛选，他们能够确定所需工艺的最佳酶（来自酿酒酵母的KR）。
酶固定化和流动化学：连续工业生物催化 在固体支持物上共固定多酶系统的许多例子已经改善了生物催化剂在共溶剂存在下的长期稳定性，并允许它们集成到流动反应器中。此外，已报道了辅因子和多酶系统的共固定，并已成功集成到连续流动中。在 Scott 和同事最近的一项研究中，将不同的酶设计为融合蛋白，以开发由三个域组成的人工生物催化剂，即催化单元、辅因子回收单元和固定单元。整合来自不同领域（例如分子生物学、合成化学、材料化学和工艺开发）的知识和工具对于推动更可持续的药物合成至关重要。事实上，酶级联应用方面的进展与这些策略的成功密切相关，不仅可以获得在稳定性、活性或特异性方面更好的催化剂，还可以产生可扩展且高效的工艺。 从这个意义上说，使用固定化酶可以让我们超越酶所表现出的一些主要局限性，并可以强化它们的使用。
总结与展望：
循环生物经济模式的稳步发展需要创新方法，利用自然提供的工具和材料，即向自然学习。这也是学术界和工业界应遵循的一条富有成果的道路。在尊重环境的同时实现开发新技术和新产品的平衡的最终目标需要不同学科的融合，而生物催化已被证明起着关键作用。酶作为生物催化剂不仅有助于提高工艺的绿色性，而且有助于提高工艺的效率。尽管迄今为止已报道了许多基于酶的反应实例，甚至发展到工业水平，但其中大多数仅涉及一种酶。本文讨论了多步酶级联的优势，这是一种非常有吸引力的策略，可用于开发（复杂）药物的合成路线并避免中间体的纯化。在制药领域，多步酶级联的应用受到了极大的关注，特别是因为酶能够产生光学纯的手性分子。 此外，使用温和的条件（通常与级联反应中涉及的所有生物催化剂兼容）推动了人们更喜欢使用酶作为催化剂。多步酶级联的许多例子都集中在生产相对较小的分子，作为随后合成药物的基础。然而，研究人员在这里总结了其他新兴研究，这些研究强调了酶级联在药物最终产品中的潜力，从最简单到最复杂的分子结构。这些合成路线是用整个细胞或纯化的酶进行的，甚至是两者的结合。此外，化学催化步骤已被纳入级联反应，这导致了化学酶促合成策略的出现，而这仅靠酶是无法实现的。然而，要在制药行业全面实施多步酶级联，仍有几个挑战需要克服。
生物催化的一个重要障碍是底物负荷仍然很低，这阻碍了生物催化过程的可扩展性。如合成所示，通过定向进化或信息工具指导的酶工程开发改良的酶变体可以在一定程度上缓解这一问题。计算研究的使用也最大限度地提高了发现具有新催化活性的酶的机会，这为新型酶级联及其与大规模过程的整合打开了广阔的窗口。与多步酶级联的实施特别相关的是反应条件和底物范围的互补性，以避免与中间体发生不良反应。上述技术可以解决这两个问题（例如酶工程、酶发现和蛋白质固定化）。
最后，多级酶级联在工业过程中的应用需要生物催化剂的高稳定性和高效率。已经开发了几种技术来固定多级酶级联并将酶级联集成到流动反应器中以实现工艺强化。这些领域的新进展对于支持酶在未来作为替代化学催化剂极为重要。总之，我们仍处于用于药物合成的多级酶级联的早期阶段，但对酶级联的更好理解和新技术的发展使人们乐观地认为该领域将在可预见的未来蓬勃发展。
参考：
AI-，D.Roura，F.，作为路线绿化和，Nat Chem，14（2022）489-499。