镍废水处理 科研 | Water Research：阐明河流抗生素耐药基因组:人为输入的下游归趋
通讯作者单位：瑞士联邦水科学与技术研究所（EAWAG）
实验设计
本文在瑞士苏泽河和穆尔格河各选取一个河段，每个河段仅有一个排污口，河段上游没有已知的排污口。苏泽河于2018年7月9日（VIL1）、2018年7月19日（VIL2）、2018年7月30日（VIL3）、2018年11月5日（VIL4）进行了4次采样，穆尔格河于2018年7月26日（MUE1）、2018年8月3日（MUE2）、2018年8月6日（MUE3）进行了3次采样。同时收集了污水处理厂排出的废水，记为EF。
采样时及时测量温度、电导率、pH、溶解氧等理化指标。为了减少流速对实验结果的影响，本文进行了盐示踪试验。为了对环境中的抗生素耐药性指标进行全面评估，我们结合多种方法：在含有抗生素的培养基上培养异养菌，通过qPCR定量分析人为源抗生素耐药基因关键指标，并使用鸟枪法宏基因组测序对选定样品中的耐药基因组进行广泛分析。同时，本文还利用化学分析方法测定样品中的金属、离子、营养物质和溶解有机碳；利用保守示踪剂等物理方法探究和计算稀释效应和河流流量。
结果与讨论
1 上游水质及污水处理厂排放
除了在 MUE2 中观察到的 ermB 和 intl1 水平升高外，污水处理厂上游的 intI1 和目标 ARG 的拷贝数通常较低。化学水质同样表明没有来自支流或上游的显著污染输入，大多数微量污染物都低于 VIL 和 MUE 的最低定量浓度。偶尔，检测到一些微量污染物的浓度非常低。对于可培养的多重耐药细菌，尤其是 CLR/TET 耐药细菌，在 VIL2 和 MUE2-US 样本中观察到更高的上游值。这些发现表明，虽然没有发现显著的上游污染，但一些污染，可能是来自城市或农业周期性活动的污染，可能会影响河流。污水处理厂上游存在定居点和牲畜活动。虽然我们假设来自农业场所的地表径流很少，因为我们的采样是在干燥的天气条件下进行的，但不能排除一些来自农业活动的输入偶尔会影响河流。本项目未对这些瞬时微生物污染的性质进行进一步研究，但未来的工作可以使用微生物源追踪或微生物指纹技术来确定其来源。
两座污水处理厂的出水中均含有大量的污染物，如钠的排放浓度比上游高出约1个数量级，ARGs和intI1的排放浓度比上游高出1-2个数量级，痕量污染物的排放浓度比上游高出2个数量级。这些结果与之前对瑞士河流中痕量污染物的大规模研究结果一致。
2 下游河流抗生素耐药性决定因素的短距离趋势
重点关注污水处理厂出水的直接影响，污水对 VIL 和 MUE 的排放河流均产生了重大影响。通过电导率法估算下游受纳水体中的出水比例，VIL1-4 中为 10.5% 至 35.9%，MUE1-3 中为 33.0% 至 38.0%。因此，与 US 相比，D1 处通过 qPCR 定量的 sul1、ermB、tetW 和 intI1 基因拷贝数显著增加（P 配对 t 检验）。然而，VIL 和 MUE 中这些抗生素抗性指示基因的测量水平分别在下游 2.5 公里和 2 公里处（D2 或 D3 位置）迅速下降至接近上游水平。
在耐多药细菌中也观察到了同样的动态，尤其是耐 CLR/TET 的细菌。SMX/TMP/TET 的抗性通常低于检测限（5.0 CFU/mL），但在 D1 样本中明显高于检测限，因此也高于下游。
有几个过程可能会降低抗性决定因素，包括地下水或支流输入的稀释、生物降解（例如由于阳光照射、较低的环境温度、捕食等导致的细胞死亡或休眠）以及细胞沉积。
3 稀释效应强烈影响废水阻力决定因素的短程动态
为了确定稀释效应的重要性，我们比较了根据保守化学示踪剂浓度（例如钠、4/5 甲基苯并三唑、卡马西平）计算的 WWTP 排水口下游短距离的 DP 值（DPD1-2 为 VIL；DP D1-3 为 MUE）以及 ARG 和 intI1 水平。目标抗生素耐药性指示基因 DPD1-2/3 的水平始终高于保守示踪剂的水平，表明存在潜在的拷贝数减少机制。然而，在生物体和保守指标之间的稀释参数没有显着差异的零假设下，使用配对 t 检验，P（P 用-方法校正）只有 sul1 和 tetW 与钠有显着差异，证实了非保守行为和额外的拷贝数减少机制。由于钠 DPD1-2/3 占 sul1 和 tetW 值的很大一部分，钠定量的稀释效应解释了这些参数中大部分浓度下降。这一结果说明，污水到达污水处理厂下游后，抗性决定因子的拷贝数水平迅速下降主要是由于稀释效应所致。因此，在研究抗性决定因子的环境命运时，需要认真考虑稀释效应，并且为了准确评估环境命运，需要确定拷贝数而不是浓度。
4在更远的下游距离，额外的源/汇的影响显著
我们假设额外的源/汇机制会影响更远距离抗生素抗性指示基因的下游动态。为了更详细地分析这一点，通过将阻力水平乘以每个位置的流速，以及下游远处和近处的负荷，计算出排放点的目标 ARG 和 intI1 的每日负荷，然后进行比较。流速要么直接从附近的测量站获得，要么通过使用钠作为指标并基于质量守恒假设得出的方程式，考虑流出物流量来估算。
目标抗生素抗性指示基因的下游动态在不同指标和采样之间有所不同。例如，对于所有样品，从废水排放到最下游地点，ermB 和 tetW 基因的拷贝数均显著且持续地减少。对于距离超过 13.7 km 的 VIL1~4，ermB 和 tetW 基因的平均拷贝数分别减少了 81±17% 和 70±15%；对于距离超过 6.8 km 的 MUE1~3，ermB 和 tetW 基因的平均拷贝数分别减少了 95±5% 和 96±2%。相反，基因 sul1 拷贝数的下游动态在采样期间不一致。VILI~4 随距离增加而显著减少，但 MUE1~2 并没有随距离的增加而显著减少，而 MUE3 显著增加。基因 intI1 的下游命运也是多变的。例如，基因intI1的拷贝数不仅没有减少，在某些情况下甚至有所增加。
图 1 通过 qPCR 定量上游污水排放点附近和下游河水中 sul1 和 intI1 水平（基因拷贝数/mL）。（a）苏西河和（b）穆尔格河中 sul1 和 intI1 基因的平均浓度。虚线是基于使用钠、（CBZ）和 4/5-甲基苯并三唑（4/5 MeBT）作为保守示踪剂的公式估算的水平，仅考虑稀释效应作为主要驱动力。浅红色垂直线表示排放点。符号代表平均值，误差线分别是生物体拷贝数的上限和下限。对于此处显示的所有样本，基因 sul1 和 intI1 的检测限为 12.5 拷贝/mL。
为了进一步分析sul1和intI1是否存在偏离保守动力学的断点，我们以稀释度为主要驱动因素，计算了研究距离内抗性决定因素的预测水平。图1展示了基于三种不同的保守示踪剂对sul1和intI1的预测。在VIL中，除了VIL2中的intl1基因外，测量水平始终低于预测水平。相反，在MUE样本中，有几处测量值超过预测值的情况，甚至在大多数下游位点的intI1基因也是如此。MUE3显示从D5到拷贝数显著增加，在5到6.8公里的距离内，sul1基因拷贝数开始超过预测值。在MUE3中，基因intI1拷贝数也在下游5~6.8km的距离内快速增加，表明在河流延伸处或存在非点源污染，sul1和intI1基因拷贝数有明显增加，我们将在第10节讨论可能的机制。
许多机制可以解释普遍观察到的拷贝数减少：沉积和捕食导致的细胞死亡、紫外线或不利于废水细菌的各种环境条件。根据现有数据，我们无法确定各种机制的作用。未来的研究可以通过研究抗性细菌或分子抗性标记在微观或中观实验或模拟自然流动的湍流系统中的停留时间来回答这些问题。使用有关颗粒大小、质量和流动特性的信息对废水衍生颗粒的输送和沉积进行建模可以提供有关沉积重要性的信息。
5 污水处理厂废水影响下游河流抗生素耐药性基因组
为了更广泛地了解河流抗生素耐药性基因组，我们从选定样本（VIL1、MUE 2 和 MUE 3）的宏基因组数据中检查了 ARG 拷贝数。总体而言，共鉴定出 65 种 ARG 亚型，其中 49 种在河流上游和下游样本中均有发现。距离排放点最近的水中（D1）的抗生素耐药性基因组受到排放的显著影响。例如，在 D1 中发现的 36 种 ARG 亚型中有 28 种也在污水中检测到，而其中 16 种 ARG 亚型在美国未发现。在污水中检测到的 16 种耐药基因对以下抗生素类别产生耐药性：1×氨基糖苷类、4×β-内酰胺类、1×氯霉素、2×大环内酯类、1×喹诺酮类和 4×四环素类；3 种亚型是多药耐药基因。在这 16 种基因中，有 14 种在更远的下游位置不再检测到。这与 ARGs 和 intI1 的 qPCR 定量结果一致，这意味着大多数 ARG 仅存在于污水中，并且在具有大量额外水流入和拷贝数减少机制的河流中并不能够长距离持续存在于可检测的水平。
6 河流中耐药基因组和微生物基因组的多样性
我们分析了河流中耐药基因组和微生物基因组的 α 和 β 多样性，我们想从另一个角度来研究污水处理厂排放的潜在影响，以及耐药基因组的动态是否与废水处理过程中观察到的微生物群落密切相关。正如预期的那样，污水中 ARG 的 α 多样性比 US 组高 20.2-25.4%。因此，随着 D1 站点河水中 ARG 多样性的增加，我们观察到了污水中耐药基因组的影响，尤其是 VILI 和 MUE3 组。在所有样本中，ARG α 多样性在下游降低。然而，对于以扩增子序列变体（ASV）为代表的微生物群落，污水中的 α 多样性并不总是高于 US 组，并且从 US 到 D1 站点 α 多样性没有持续的变化，下游也没有持续的下降。这表明整个微生物群落的下游动态与抗生素耐药基因组无关。
β多样性分析也得到了相似的结论。采用Pugh分析方法分析微生物群落与抗生素抗性基因组之间的关系，发现仅在污水污染最严重的地点（D1）（P=0.002），微生物群落与抗生素抗性基因组之间存在较强的结构相关性，当排除D1样品后，相关性几乎不显著（P=0.04），表明微生物群落与抗生素抗性基因组之间的结构相关性主要受污水处理厂排放的影响。在受影响较小的水体中，结构相关性较弱，表明缺乏强烈的驱动因素，如选择压力或外源ARB的流入。
7. 抗菌素耐药性基因组分析，以确认废水的影响和消除方法
为了更详细地定量研究河流中抗药性的动态，我们选择了七种最常见的 ARG 亚型进行详细分析，这些亚型存在于至少一半的样本中。我们根据相对丰度计算了这一组中每个基因的比例。与污水和 D1 相比，六个基因（aph(3'')-I、aph(6)-I、mexT、tetQ、aadA、sul1）在 US 组中出现的比例较低。相反，与污水和 D1 相比，基因 bacA 在 US、D5 和 D8 中出现的比例较高。因此，除了图 2b 中的宏基因组组装中 ARG 的相对和累积丰度图，以及图 2c 中它们个体和累积环境水平之外，相对和绝对丰度显示出相似的模式——与 US 相比，所选的 ARG 在 EF 和 D1 中更丰富。这六个基因的丰度随着下游位置而降低，除了 MUE3 采样中远下游位置（D8）的 sul1（图 6b）。该分析确定了废水对河流中常见抗性基因丰度的定量影响，并指出了其他候选基因（aph(3")-I、aph(6)-I、mexT、tetQ、aadA 和 sul1），可用于在未来的研究中追踪人为抗性来源，这可能有助于追踪废水中的抗性决定因素。其中一些基因已与基于培养的方法结合用作环境样品中的抗性指标，尽管很少使用不需要培养的方法。
图2 河流中常见和广泛分布的宏基因组组装ARGs的动态变化。（a）7种最常见和最广泛分布的ARGs（aph(3'')-I、aph(6)-I、mexT、tetQ、aadA、sul1和bacA）的比例。（b）和（c）是6种污水相关ARGs丰度的堆叠条形图（省略bacA）；（b）为相对丰度（GPM，每升基因），（c）为绝对丰度（GPL，每升基因）。EF样品用红色阴影表示，其他河水样品用蓝色阴影表示。
8 分析显示ARG协同位点
（拼接软件是基于reads之间的区域进行的，拼接得到的序列称为，不加N（））我们推测某些ARGs的相似动态可能是因为它们位于同一位点，或者同一宿主体内的同一遗传成分，于是对其序列的基因位置进行了分析。我们的确发现在不少VILI（EF、D1、D2和D5）样本中，基因aph(3'')-I和aph(6)-I位于同一序列中，这可能解释了VIL1中aph(3'')-I和aph(6)-I之间强烈的相似动态，R2 = 0.98（P < 0.001）。ARGs位于同一位点的另一个例子是sul1和aadA基因，在VIL1的D1中和MUE3的EF样本中都发现了包含这两个基因的序列片段。然而，与 VILI 中的 aph(3'')-I 和 aph(6)-I 不同，sul1 的动态与 aadA 的动态不同，尤其是在 MUE3 中的 D5 和 D8 中，其中 sul1 非常丰富，但没有发现 aadA 拷贝（图 2b）。与此观察结果一致，从 MUE3 中的 D5 和 D8 中检索到含有 sul1 但不含有 aadA 的序列，这些序列是这些样本中唯一鉴定出的序列（图 3b）。这表明在 MUE3 中的 D1 和 D3 之间产生含有 sul1 序列的细菌种群发生了显著变化，并且 sul1-aadA 序列并不总是存在于污水中。
图 3 aph 和 sul1 的基因排列。（a）从所有样本（VIL1、MUE2 和 3）中选出的含有 aph (3'')-I 和 aph (6)-I 的基因。（b）从 MUE3 中检索到的含有 sul1 的基因。使用蛋白质搜索和蛋白质数据库比较，所有注释基因在蛋白质水平上与参考序列的序列相似性均 >90.0%（）。ID 以斜体表示（例如）。表示样本中鉴定出的所有含有 aph 的基因的平均覆盖率与所有含有 aph 的基因的平均覆盖率总和之比。表示样本中鉴定出的所有含有 sul1 的基因的平均覆盖率与所有含有 sul1 的基因的平均覆盖率总和之比。
9 bacA，一种常见于环境细菌中的抗生素抗性基因
与其他普遍存在的基因不同，bacA（又称UppP，-或-tase）在美国样本中所占比例最大，许多下游采样点也存在大量bacA基因拷贝（MUE3中的D5和D8除外，其中sul1基因所占比例最大）（图2a）。为了进一步评估bacA基因是否存在于我们的河水样本中，我们通过结合多种方法对宏基因组组装进行分类来识别潜在宿主。我们使用三种分类方法获得了在属水平上一致相似的序列。被鉴定为bacA序列潜在宿主的四个属是、、、和。其中、、、和是淡水和土壤环境的典型物种。然而考虑到bacA在样本中总bacA基因中所占比例以每千碱基读段计算较低（MUE3中的D8除外），我们假设bacA基因的同源基因可能存在于许多其他环境细菌中。因此，我们的数据表明 bacA 基因可能不适合追踪人为的抗生素耐药性来源。
10 探究MUE3下游远区sul1快速增多的原因
基于 qPCR 和宏基因组的分析均证实 MUE 下游 sul1 和 intI1 基因拷贝数增加，特别是在距离一个采样点（MUE3）下游 5.0 至 6.8 公里之间。
为了弄清 sul1 和 intI1 的这种意外增加是否归因于生物驱动因素，我们首先对含有 sul1 的序列进行了表征。众所周知，sul1 基因是普遍携带的，通常与 intI1 基因相连。事实上，从河流中获取的所有含有 intI1-sul1 基因（D3~8）的序列都是单显性同源物，它们似乎也与质粒有关，因为它们含有与质粒相关的基因 parA。毫无疑问，我们无法从这些序列中获得有意义的分类。因此，无法证明 MUE3 下游的增加是由于污水、环境中的生物还是当地污染源造成的。在未来的研究中，使用宏基因组分析可能会提供更深入的信息。因此，我们转向化学指标，进一步调查是当地污染还是非点源污染是原因。
为了评估非点源污染物的输入，我们选择了一些可以作为污染指标的微量污染物。磺胺二甲氧嘧啶 (SDM) 用于养猪/畜牧业，甲基丙烯酸 (MEP) 是一种主要用于瑞士城市环境的除草剂。假设如果农业或城市地表径流大量存在，这些污染物的水平将在下游地区增加或保持高水平，这可能与农业或城市地区存在抗性基因和抗性细菌有关。在 VIL 中，除一个美国样本外，所有样本中的 SDM 均低于检测限 (LOD 0.8 ng/L)，而在 MUE 中，废水排放含有 SDM，尤其是在 MUE3 的采样期间，但在下游位置未观察到这种化合物的增加。丙酸 (PPA) 的浓度和下游动态在不同的采样中有所不同。对于 VIL1–3、MUE1 和 MUE3，丙酸浓度较低（< 60 ng/L），而似乎有大量废水输入的 MUE2 在下游仍然有较高的浓度（> 200 ng/L）。MUE3 1.0 至 2.0 公里之间和 MUE2 下游 5 公里以上处的丙酸略有增加，这可能是由于污水处理厂污水输入波动造成的。在更下游的位置（D8）没有观察到进一步的增加，而 sul1 和 intI1 基因突然增加。基于这些以及分析的其他微量污染物，我们没有发现下游污染源的明确证据。然而，这些化学指标并不具有决定性，因为所分析的化合物并不是追踪下游非点源的全面选择（例如，施肥或施用农药，尽管在干燥天气条件下不太可能）。因此，虽然我们没有发现这些污染物的证据，但我们不能排除它们导致 MUE3 中 sul1 和 intI1 基因明显增加的可能性。
最后，使用 MUE3 下游位点的抗生素和重金属浓度评估了原位抗性选择的可能性。磺胺甲恶唑及其衍生物 (N4-le) 在所有分析的抗生素中浓度最高，但下游浓度仍远低于已公布的抗性选择预测无效浓度 (PNEC)。通常与磺胺甲恶唑一起开具的甲氧苄啶 () 的浓度也远低于抗性选择的 PNEC。虽然本研究中分析的绝大多数金属低于其定量限或低于水中溶解金属的估计最低共选择浓度 ()，但两种金属（铜和镍）的浓度高于这些（Cu 为 1.5 μg/L，Ni 为 0.29 μg/L）。然而，是一个预测值，实际选择水平可能高于同时采样的其他站点，并且不同采样时间同一站点的 sul1 和 intI1 基因的增加并不明显。此外，我们基于 MUE 的共定位搜索也未能发现 sul1 基因与任何其他可能与抗 Cu、Ni 或任何其他金属相关的基因共定位。总体而言，没有可靠的证据表明对 Cu 和 Ni 的原位抗性共选择导致下游 sul1 和 intI1 基因的增加。我们进一步注意到，估计的河流停留时间相对较短，这使得水柱中原位抗性选择的可能性更低。
作为最后的可能解释，我们考虑了细胞从其他河流迁移过来的可能性。基于表层沉积物中ARGs和intI1基因的qPCR计数，我们没有观察到MUE3中D5和D8中sul1和intI1基因的绝对和相对丰度水平的增加。此外，沉积物中sul1和intI1基因的相对丰度与MUEl~3基本相似甚至更低。如果沉积物再悬浮是MUE3 D8水柱中sul1和intI1基因增加的主要原因，那么水样中sul1和intI1基因的相对丰度将保持不变或降低。虽然我们不能完全排除沉积物再悬浮的可能性，但我们假设sul1和intI1基因在绝对和相对丰度方面可能从其他来源（如流动的生物膜）中选择性富集。系统内生长是一个合理的假设，因为在 MUE 中，由于污水输入量高、下游稀释效应较低，抗性决定因素和营养物的下游含量相对较高，尤其是在第三次采样时。
MUE3 采样期间 sul1 和 intI1 基因显著增加的原因和性质仍未解决，因此需要进一步研究。我们的观察清楚地表明，ARG 的增加可能是意料之外的，可能不是由人为污染直接造成的。特别是，sul1 和 intI1 基因通常用于追踪环境中 ARG 的人为输入源，我们建议监测策略应采用多目标策略以确保稳健性和可靠性。
综上所述
下游 2.0-2.5 公里范围内 AMR 决定簇丰度的快速下降是由于稀释效应，而更远距离范围内的衰减是由于其他拷贝数减少机制。这表明，只有在靠近排放点（几公里）时，公众才可能面临污水衍生 AMR 的严重风险，尤其是在有大量径流输入的情况下。
我们在这条河中观察到了至少一个 sul1 和 intI1 基因动态增加的例子，但没有发现与当地的人为污染有任何关联。其他可能发生生物量增长的河道内区域可以作为未来研究的监测目标。
基于宏基因组学的抗药性分析结果与选定的靶向 qPCR 分析结果一致，表明未来监测人为抗生素耐药性来源的候选基因。在一般宏基因组学研究中，基于 qPCR 和培养实验观察到一致的动态。公共卫生建议可以基于定量指标基因或基于培养实验的技术上更简单的指标。
抗性组和微生物组之间的结构相关性较弱，且（共）选择因子水平较低，这表明在受干扰较少的河水中（距离下游 3 公里以上，加上上游位置）缺乏驱动因素。
我们发现，基于分类学的分类方法和组装 ARG 的遗传邻域分析可以揭示有关 ARG 宿主转移、动员和 ARG 共定位位点的重要信息，否则这些信息将被埋没。