废水生物处理磷过程
1 简介
为有效控制水体的富营养化，强化生物除磷（EBPR）在废水生物除磷过程中起着关键作用（等，2007）。强化生物除磷是在厌氧-好氧交替操作条件下，活性污泥中的聚磷微生物被选择性富集为优势菌。在厌氧阶段，聚磷菌（PAOs）通过分解胞内聚磷酸盐产生的能量来吸收胞外挥发性脂肪酸，同时降解糖原提供还原力来合成聚β-羟基脂肪酸酯（PHA）；在好氧阶段，聚磷菌利用分解胞内PHA产生的能量进行细胞生长、聚磷酸盐合成和糖原回收，并通过好氧终端排泥达到生物除磷的目的。
糖原是强化生物除磷过程中产生的胞内聚合物，聚磷菌在厌氧条件下吸收底物不仅利用分解聚磷酸盐产生的能量，而且通过提供糖原提供部分能量和还原功。因此，提供一种快速分析污泥胞内糖原含量变化的方法，有助于进一步了解强化生物除磷的原理。目前，污泥胞内糖原的化学测定主要采用蒽酮比色法。测定原理主要是对冻干污泥进行不同方式的预处理，利用强酸使糖脱水生成醛，生成的醛或羟甲基醛与蒽酮脱水缩合，生成蓝绿色的醛类衍生物。该物质在波长600～650nm处有最大吸收，且吸光度值与糖原含量呈线性关系(Chen et al.，2005)。
蒽酮法测定污泥胞内糖原含量较为繁琐，且容易对污泥样品造成不可逆的损伤。污泥的红外光谱分析也是测定污泥胞内糖原含量的重要分析方法。近年来，随着科技的不断发展，傅里叶红外光谱技术逐渐在科研领域得到广泛的应用。红外光谱技术可以对微克甚至纳克级样品进行定性和定量分析，具有过程简单、噪声低、光通量大、分辨率高、波数精度高、光谱范围宽、扫描速度快等优点（翁世富，2005）。
糖原是葡萄糖通过化学键聚集而成的高分子化合物，具有特征红外光谱吸收峰。Garip等(2009)研究了不同种属细菌的红外光谱，发现糖原的红外吸收峰位于-1和550cm-1处。Chu等(2007)研究了人体组织中正常细胞和癌细胞的红外光谱，考察了蛋白质、核酸和糖原特征峰的峰位和峰强度，比较了糖原与蛋白质的峰强度比，定性和半定量评价了正常细胞转化为癌细胞的过程。因此，通过糖原特征峰强度的变化可以定性或半定量表征糖原含量的变化。此外，还可以采用偏最小二乘法(PLS)或BP神经网络算法对各类样品的红外光谱进行定量分析。例如李振清等(2009)利用改进的偏最小二乘回归法，以选定的波长区域与巴氏纯乳中的脂肪、蛋白质和乳糖成分建立模型，结果表明模型拟合度较高，获得了很好的预测效果。林萍等(2009)利用偏最小二乘与人工神经网络相结合的方法，对白砂糖、木糖醇、双歧糖和葡萄糖进行了定性区分和定量分析。活性污泥样品是一种非常复杂的混合物，在前期研究中，本课题组已通过对污泥样品与标准样品的红外光谱峰进行对比，初步确定了糖原的特征吸收峰，并利用特征峰强度比值对活性污泥中的糖原含量进行了初步的定量表征(李锐，2012)。但仅通过峰位对比来确定目标物质的特征吸收峰较为粗糙。若能采用标准加入法定性表征污泥中的糖原峰，便可得到污泥样品中一系列糖原物质的特征吸收贡献区域，在此基础上选取特征光谱区间，采用偏最小二乘法或人工神经网络法建立样品红外光谱与糖原含量的关系模型，可用于未知样品的快速表征和定量分析。基于此，本文利用傅里叶中红外光谱技术表征强化生物除磷过程中污泥中的胞内糖原物质，并将污泥样品的红外光谱与糖原标准样品进行对比，同时将红外光谱945~1150 cm-1区域的吸收光谱数据与测得的胞内糖原含量相结合，分别采用偏最小二乘法和BP神经网络算法建立污泥红外光谱与糖原含量的定量分析模型。
2 材料和方法
2.1 反应器描述
采用序批式反应器（SBR）富集聚磷菌达到强化生物除磷的目的。反应器有效容积为4 L，一个循环为8 h，每循环进水2 L。以乙酸钠为唯一碳源，COD为400 mg·L-1，NH4Cl为微生物唯一氮源，NH4Cl为微生物磷源，进水中磷浓度为20 mg·L-1，碳磷比为20∶1。单循环时间设定见表1。反应器水力停留时间为16 h，每个循环好氧结束时排污150 mL污泥，污泥停留时间为8.9 d。
表1 反应堆各级运行时间
2.2 反应堆进水成分
反应器中的合成废水由0.3 L溶液A和1.7 L溶液B组成，溶液A和溶液B的组分如表2所示。
表 2 反应器进水组分列表
2.3 样品采集及实验方法
反应器注满水后，分别在0、30、60、90、120（厌氧端）、150、180、240、300 min（好氧端）取样，共进行3次平行试验。所有样品与水分离后得到上清液和湿污泥样品。将湿污泥过滤后放入FD-1A-180冷冻干燥机中冷冻干燥24 h，得到冻干污泥。取样品上清液，按照《水与废水监测分析方法》（魏福生，2002）对COD和正磷酸盐进行检测分析。
冻干污泥的蒽酮比色测定方法如下：取冻干污泥10mg，加入%硫酸溶液，反复振摇，在100℃下消化10min，取1mL稀释至10mL，再从10mL中取1mL在冰水浴中加入5mL蒽酮试剂（取0.2g蒽酮溶于80%硫酸中，再用80%硫酸定容至100mL，新鲜配制使用），移入沸水浴中加热10min，取出试管放回冰水浴中冷却至室温，用分光光度计测定620nm处的吸光度值。
采用中红外透射法测量样品时，基质溴化钾(KBr)与样品合理的压缩工艺，可有效避免测量光谱时的克里斯滕森效应(黄东晨等，2013)。因此，冻干污泥的傅里叶变换红外光谱检测方法为：以KBr为背景，用研钵将KBr压成薄片，放入傅里叶变换红外光谱仪中进行扫描，得到背景光谱；将待测污泥样品的1%加入KBr中，在研钵中混匀，压成薄片，再放入傅里叶变换红外光谱仪中进行扫描，得到待测污泥样品的傅里叶变换红外光谱。
3 结果与讨论
3.1 反应堆运行状态
图1为第一次实验的化学分析结果，从所测化学指标可以看出，反应器进水COD为166.5 mg·L-1，正磷酸盐浓度为22.5 mg·L-1。经过30 min的厌氧搅拌，废水中的COD基本完全降解，可能是由于活性污泥初始吸附造成底物浓度快速降低所致；厌氧结束后2 h COD降解为81.0 mg·L-1，正磷酸盐浓度上升至160.5 mg·L-1。聚磷菌中磷的释放量是进水的6倍，说明随着底物（乙酸钠）的不断降解，微生物细胞内的聚磷酸盐被利用并降解为正磷酸盐并释放到细胞外的水中，导致水体中正磷酸盐含量增加，厌氧端水体正磷酸盐浓度达到最大值。经过3 h曝气处理，随着水体中COD的进一步降解利用，水体中的正磷酸盐被微生物过量吸收并以聚磷酸盐的形式储存在细胞内，好氧端COD为48.0 mg·L-1，正磷酸盐浓度为15.44 mg·L-1。每循环排放150 mL污泥即可达到生物除磷的目的。
图1 SBR反应器运行过程中水质指标及胞内糖原含量的变化
EBPR反应器处理废水过程中，糖原不仅能为厌氧阶段提供部分能量，还能为PHA的合成提供还原动力。厌氧阶段消耗的糖原由好氧阶段PHA的分解利用和底物的进一步消耗进行补充。从图1中可以看出，在厌氧处理结束时（120 min），污泥胞内糖原含量达到最低，占污泥总质量的6.45%。曝气3 h后，污泥胞内糖原含量上升至8.78%。这说明在生物除磷过程中，污泥细胞内的糖原物质参与了微生物的活动。
3.2 标准污泥胞内聚合物红外光谱分析
由于多糖分子中C—OH伸缩振动频率与醇分子基本相同，都在1 200～1 000 cm-1之间，但多糖分子中C—OH基团有多个，因此从图2a中可以看出，在此区域常常出现几个峰，图中1020，1082，1158 cm-1处的特征峰即来自糖原分子中C—OH的吸收（et al.，2011）。从图2b中可以看出，多磷（poly-P）有两个主要特征峰，主峰在1167 cm-1处，次峰在900 cm-1处，分别是PO2的对称伸缩振动和P—OH基团的伸缩振动引起的吸收峰。从图2c和2d可以看出，PHB的红外特征峰主要位于1723 cm-1处，而牛血清白蛋白（BSA）在1657 cm-1和1541 cm-1处分别有较强的I吸收峰和II吸收峰，这与以前文献（et al.，2005；Adt et al.，2006）中报道的结果一致。
图2 标准糖原、多磷酸盐、PHB 和牛血清白蛋白 (BSA) 的红外光谱
为了进一步说明污泥中糖原分子的C—OH基团在1020、1082和1158 cm-1处有较强的吸收峰，在污泥样品中添加不同量的标准糖原样品，得到的光谱如图3所示。从图3可以看出，添加糖原后，1020、1082和1158 cm-1处的红外光谱明显增大，且随着糖原添加比例的增加，吸收峰强度明显增强，其中1020 cm-1处的吸光度分别由0.185增大到0.237和0.379。因此，应优先选择该位置的红外峰作为糖原的特征峰。
图3 添加不同比例标准糖原物质后活性污泥的红外光谱
3.3 污泥样品的红外光谱分析
图4为第一次试验中污泥样品在各个采样时间点的红外光谱图。由于污泥样品在1 158 cm-1处的吸收峰强度不是很明显，因此采用1020 cm-1和1082 cm-1处糖原分子的吸收峰强度来反映污泥细胞内糖原含量的变化。至于1020 cm-1处的红外吸收，在进水初期污泥细胞中糖原分子的C—OH特征峰强度较高，吸收值为0.611。进入厌氧阶段后，强度逐渐减弱，厌氧1 h后降至0.585，厌氧阶段结束时达到最低，降至0.549。经过好氧阶段处理后,胞内糖原特征峰强度明显增加,好氧1、2、3 h红外峰吸光度在1020 cm-1处分别为0.584、0.619、0.648,与蒽酮比色法测定的糖原含量趋势明显一致。
图4 反应器不同运行节点污泥样品红外光谱
3.4 基于偏最小二乘和BP神经网络算法的污泥胞内糖原含量定量分析模型
利用前两次实验获得的945~1150 cm-1区域内18个样品的中红外光谱数据建立模型，并利用第三次实验获得的9个污泥样品数据验证模型的有效性。将光谱数据归一化后转化为吸光度数据，利用偏最小二乘法建立光谱数据与化学指标之间的定量分析模型，结果如图5、图6所示。
图5 交叉验证预测残差平方和PRESS随主成分个数变化趋势
图6 提取出的自变量和因变量信息随主成分个数变化趋势
以光谱数据为自变量，以糖原化学分析结果为因变量，采用偏最小二乘法提取自变量的主成分个数。从图5、图6可以看出，随着主成分个数的增加，交叉验证预测残差平方和PRESS呈现逐渐减小的趋势，而提取出的自变量和因变量信息量一直呈现增加的趋势。当自变量的主成分个数为4时，PRESS基本已达到最低点，反映了99.52%的自变量信息和98.68%的因变量信息。随着主成分个数的继续增加，PRESS虽然增加，但反映的信息量变化很小，说明过拟合后给模型添加了噪声成分，模型预测效果会变差（朱尔毅，2005；吴桂芳等，2008）。因此本模型最佳主成分个数选取为4，此时测量值与预测值的相关性如图7a所示。
图7 测量值与预测值相关性图（a.PLS方法；b.BP神经网络方法）
BP神经网络算法以选取的中红外光谱数据作为训练样本集，以污泥胞内糖原化学指标作为测试样本集。第一隐含层神经元个数为5，采用双曲正切S型传递函数（）；第二输出层神经元个数为1，采用线性传递函数（），采用弹性梯度下降法的训练函数（）。网络配置参数设置为训练显示间隔50次，最大迭代次数500次，学习步长0.05，期望目标误差最小值为10-4。对网络进行10次训练，从10次训练结果中选取相关性最高的作为污泥胞内糖原含量的预测模型。预测模型的均方误差（MSE）随着循环次数的增加而减小，最后基本达到期望目标误差最小值。其变化过程如图8所示，其相关性如图7b所示。
图 8. 均方误差 (MSE) 与循环数的关系。
采用偏最小二乘法和BP神经网络算法建立污泥样品红外光谱与胞内糖原化学指标之间的分析定量模型，两个模型得到的糖原测量值与预测值的相关系数分别为0.921和0.893。利用第三次试验的9个污泥样品验证了上述模型的有效性，误差分析对比见表3。
表 3 测量值与预测值糖原含量比较
偏最小二乘模型的交叉验证均方根残差为RMSEC=0.22%，预测值的平均绝对误差为0.19%，BP神经网络算法模型的预测值的平均绝对误差为0.32%，说明偏最小二乘法的平均绝对误差比神经网络算法小。由于BP神经网络算法的预测能力受隐层神经元数目的影响，若隐层神经元数目过少，网络中的权值不足，此时的网络不能很好地描述样本集的内在规律，即不能得到良好的预测数学模型；若隐层神经元数目过多，又会出现过拟合，使误差变大（焦淑飞等，2010）。而偏最小二乘法不受这些因素的影响，在线性相关性方面明显优于BP神经网络算法。因此偏最小二乘法是一种快速有效的污泥胞内糖原定量分析方法，具体方法请参见污水宝商城资讯或更多相关技术文献。
4 结论
1)在厌氧、好氧交替的强化生物除磷过程中，伴随着底物乙酸钠的降解，污泥细胞中的糖原经历厌氧分解和好氧合成两个过程，其变化可以用红外光谱表征。
2）污泥样品红外光谱中1020 cm-1和1082 cm-1处的峰来自于糖原分子中C—OH的贡献，该特征峰的强度可以直观地反映生物除磷过程中污泥细胞内糖原的变化过程。
3）采用偏最小二乘法与BP神经网络算法，建立污泥样品在945～1150 cm-1区域的红外光谱数据与蒽酮比色法测定的化学指标之间的定量分析模型。结果表明，偏最小二乘法对污泥胞内糖原含量的预测精度优于BP神经网络算法，平均绝对误差较小，测得值与预测值的相关系数为0.921，平均绝对误差达到0.19%。