【工艺进展】新冠肺炎（COVID-19）潜在治疗药物Lufotrelvir的早期临床工艺开发| No.03
阅读指南
这是辉瑞刚刚在 OPRD 上发表的一篇文章，它描述了潜在 COVID 药物在早期阶段（最终上市）的工艺开发。笔者提出了很多发现和解决问题的策略和思路，包括合成路线的设计、条件优化的思考、杂质的控制、晶型的控制和稳定性、商业生产的思考等等，对于工艺爱好者来说是一个很好的启发，值得研究和思考。
01
前言
图 1
2019 年，出现了一种由 SARS-CoV2 引起的新型冠状病毒病。SARS-CoV2 是一种与 SARS-CoV1 密切相关的病毒，SARS-CoV1 于 2002 年导致严重急性呼吸系统综合症 （SARS）。随着 SARS-CoV2 的迅速传播，全球爆发。许多医疗机构正在寻找治疗方案，许多治疗 SARS-CoV2 感染的药物正在临床开发中（图 1）。其中一种策略是靶向 3CL 蛋白酶以选择性抑制冠状病毒复制。辉瑞公司设计了一种新的 3CL 蛋白酶抑制剂药物（图 1，化合物 1）。然而，1 的水溶性非常低（一种具有高水溶性 （>200 mg/mL） 的磷酸盐前药）（图 1，化合物 2）。（2） 它在体内被磷酸酶代谢，释放活性代谢物1并发挥药效。
在阐明临床前毒理学和 ADME（药代动力学）安全性后，开始临床评估。在实际临床评估后不久，一种类似物（图 1）也在临床开发中被开发为有效的口服生物可利用的 SARS-Cov-2 3CL 蛋白酶抑制剂。但是，作者的手稿目前正在提交中，尚未披露。本文主要介绍（2）的工艺开发。
表 1
这
辉瑞药物化学团队开发的原始路线如表 1 所示，但存在几个问题：
整个路线是线性合成，内酰胺 3 的总产量约为 5%。特别是，在第一步中，通过五步反应，从内酰胺 4 到 11 开始，将高反应性氯甲基酮片段引入路线中。这会导致大量杂质和低产量。
从 3 到 4 的氯甲基化步骤也存在问题，产量不稳定且产量相对较低。内酰胺 3 是通过文献途径制备的，但内酰胺 3 的结晶度较差，需要柱纯化。
吲哚片段 9 的路线虽然非常简短有效，但由于使用了叠氮化物这种高能化合物，因此不适合大规模生产。为了避免使用叠氮化物的安全风险，所需的叠氮化物不用于间歇反应，而是通过连续流动化学分 9 个较小的批次（1-3 kg 规模）制备。
图 2
这
产品 2 的稳定性也存在以下问题（见图 2）：
在碱性和酸性条件下，前药 2 易降解为 1。虽然 1 是活性代谢产物，但 1 在静脉注射时会沉淀，化合物 1 中有 2 需要作为杂质处理，其含量需要尽量减少。
当 pH 值 1 或 2 高于 5 时，酮α位置的手性碳易发生外消旋化。pH 值越高，外消旋越严重。
在酸性条件下，1 或 2 被水解成吲哚吟哉片段13。
因此，相应地，有几种策略可以解决这些问题：
调整片段剪接的顺序，以减少不稳定的氯甲基酮片段的频率。优选中间体具有高熔点，可通过结晶提纯，使工艺杂质得到较好的控制。
这
吲哚片段 9 的合成使用叠氮化物，不适合大规模生产，合成路线需要改变。
氯甲基酮对内酰胺 3 的反应产率低且不稳定，需要通过优化工艺来解决。
内酰胺 3 的合成需要能够在不通过色谱柱的情况下结晶和纯化。
深入研究产品 2 及其前体 1 的稳定性。
02
早期临床工艺开发
表 2
从这些思路出发，设想了新的路线，从吲哚片段 9 开始，先与亮氨酸结合开始构建13，然后引入内酰胺片段 3。这样，所有中间体都具有芳香族基团，芳香族基团通常具有较高的熔点，易于结晶和提纯。
这种新的吲哚-亮氨酸片段 13 不难合成。首先，可以通过吲哚合成的方法实现吲哚-9 的合成（表 2a）。9.以T3P为缩合剂，与甲基亮氨酸14胺化反应后，可得到中间体15，得高收率，再经甲酯水解得到关键中间体13。
对于9的酰胺化反应，需要避免碱性条件，否则会导致手性中心外消旋化。对于三乙胺尤其如此，其中碱和缩合剂当量需要仔细筛选。然而，作者发现，当使用 N-甲基咪唑、吡啶或温和碱时，即使碱当量过量，也没有发现外消旋化。酰胺化的最佳条件是在室温下，以 7 体积的乙腈为溶剂，使用 1.25 当量的 T3P 和 3 当量的 N-甲基咪唑。酰胺化反应完成后，加入 10 体积的水，可以部分去除溶剂以沉淀固体15。对于水解步骤，还需要避免碱性条件以防止外消旋化。以 5 体积的醋酸为溶剂，加 1.5 当量浓盐酸或硫酸加热条件，可充分水解甲酯。在酸性条件下，温度超过 55 °C，吲哚甲醚会被裂解生成 4-羟基吲哚，但温度可以控制在 （35−45 °C） 以避免产品分解。为了完全水解，必须在真空下蒸馏将副产物甲醇和乙酸甲酯从系统中去除（H2SO4 更容易处理，而 HCl 在蒸汽时容易抽空）。反应完成后，加入 7 体积的水稀释结晶，得到关键中间体 13，收率 80−90%。
然而，随着 9 到 13 的大规模合成，9A（2-甲基-3-硝基苯甲醚）原料及其苯酚前体的供应商缺货。因此，一些供应商开发了新的路线来避免使用原材料 9A。它通过已知的 Cu 催化 C-N 偶联方法构建了一个吲哚环。合成 9 中新路线的优势（表 2b）是采用 Cu 催化的 C-N 环组合方法，以三乙胺为配体，后一步是铜催化的，但甲氧基是通过 C-O 偶联引入的。在 C-O 偶联反应中，发现草酰酰胺配体非常有效。因此，设计了一些水溶性更好的新型草酰酰胺配体，使铜离子可以形成水溶性铜配合物，以便在后期去除。配体制备 由1当量的草酸二甲酯与2个以上的当量胺在甲醇或其他溶剂中反应，最后过滤而得。通过配体合成和筛选，发现最有效的配体是和其他类似的草酰胺配体，包括 DMAPO（表 2B）。尽管这两个配体在这种 C-O 偶联中或多或少有效，但发现由 1,2-二氨基乙烷（不是 1,3-二氨基丙烷的 DMAPO）制成的 DMAPO 类似物无效，很可能是因为与铜形成的五元环螯合物相对稳定且活性较低。
03
酰胺的氯甲基化
表3
在此之后，合成 2 的最简单方法是将内酰胺类 5 和 13 缩合，得到原始路线中的中间体 8（图 1），随后的路线 8 到 2 保持不变。然而，5 的合成需要通过 3 的氯甲基化获得，这更成问题（表 3）。首先是 3 的纯化最初需要一个层析柱，这对于小规模来说不是什么大问题，但对于以后的放大来说是一个大问题。即使 3 不需要色谱柱，反应产率也非常不稳定（约 15-50% 的产率），并且使用 LHMDS 或氯碘甲烷的 LDA 进行放大通常存在问题。对文献的深入搜索表明，使用氯乙酸或氯乙酸衍生物可能是氯碘甲烷的替代品。实验证明，使用氯乙酸锂盐或其烯醇化盐镁盐时反应相对稳定。在 −10°C 间歇反应中，4 的产率稳定在 40−50%。当切换到连续流反应器时，分离收率可以提高到约 60%，转化率可以提高到 90%。最初，使用 LHMDS 的 THF 溶液，因为它在实验室中很常见，但后来发现氯乙酸的镁盐也可以达到类似的结果。用氯乙酸醇化的锂盐往往会产生固体，这会堵塞连续流反应器。推测体系中的不溶物可能是氯乙酸的单锂盐，尚未进一步烯醇化形成溶解度较高的二锂盐。如果使用连续流化学进一步开发这条路线，则找到具有良好溶解度的乙酸盐并使其形成烯醇酸盐应该可以解决连续流反应中遇到的堵塞问题。然而，最终选择了另一种路线，尽管仍然是缩合反应，但具有不同的底物（参见下文第六部分中对商业化路线发展的讨论）。
使用连续流反应工艺获得中间体 4 后，用 HCl、MsOH 或 TsOH 脱保护后可获得化合物 5。虽然 5-盐酸盐或对甲苯磺酸盐是一种油，但对甲苯磺酸盐相对容易结晶，可以纯化和控制杂质。然而，在早期研究阶段，5 在大多数情况下，它没有被纯化，直接用于下一个酰胺缩合反应。
图 3
在研究 13 和 5 的酰胺缩合反应时，发现该产物易发生外消旋化，推测 13 的噁唑酮中间体是在羧酸活化过程中形成的，羧酸活化发生外消旋（图 3）。在第一批毒理学批次材料的制备中，将DMF和HATU以及两种底物放入一个锅中，并在−20°C下缓慢加入二异丙乙胺，可以大大减少外消旋化的发生。 在 10−20 g 规模下，DR 值 8 通常介于 90：10 和 96：4 之间，分离产率为 55–60%。当放大至约 500 g 时，发现 pH 值随碱和 HATU 补料速率的不同而变化，导致产品纯度差（约 90-94%），DR 值低至 8（80：20 至 85：15），并且需要色谱柱纯化（纯化可提高至 >99%，产量为 57%）。
这需要进一步优化流程。在筛选路易斯酸时，发现添加锌盐会抑制外消旋化13。使用乙腈中 Zn（OTf）2 和 EDCI（而不是 HATU）的化学计量量，在约 600 g 的比例下，dr 值 8 可以从 85：15 增加到 92：8。结晶后DR值8可提高到95：5以上，收率43%。不过这里也存在一个问题，那就是产量不高，只有产量中等，所以其他路线也尝试过了（见下文）。
表 4新
路线不是使用原始方法的三步法（图 1），后者将氯甲基酮转化为羟基衍生物并通过水解和磷酸化，而是直接进行与受保护的磷酸盐的烷基化8（表 4）。在非质子溶剂中，磷酸二叔丁基钾 （） 的烷基化反应顺利进行。该反应的可用溶剂包括乙腈、丙酮或甲基乙酮（15 体积）。还需要用于原位反应（氯制碘）的碘化物的催化量，作者使用了 0.2 等效的四丁基碘化铵。常规脱盐后，溶液可直接用于下一步的脱叔丁基脱保护，然后可得到 2。第一代路线在 30-50 °C 下用 10 个等效浓 HCl（15 体积的 iPrOH）脱保护，2 个直接结晶以获得非化学计量水合物。然而，很难去除 2 中残留的 iPrOH，需要在圆盘真空烘箱中高温加热。这种高温干燥操作适用于小批量毒理学批次，并且可以提供有关固体结晶形式的一些信息，特别是对于容易产生水合物的化合物和溶剂化合物2。
表5
第一个临床批次是在毒理学批次交付后不久生产的（表 5）。除了一些工艺调整外，合成工艺基本保持不变。磷酸化烷基化反应溶剂由乙腈变为 MEK（15 体积），MEK 也用作脱保护溶剂。用 MEK 脱保护时，可以用 20 当量 TFA 代替 HCl，将反应温度降低到 20−30°C。反应完成后，沉淀的固体是 2 MEK 溶剂复合物，产率为 61%（2 步），纯度为 97.9%。形成 2 的 MEK 溶剂复合物对于杂质控制是必需的，即使 MEK 是最终产品 2 的溶剂残留物，需要去除。
对于 2 的多晶型物，最初选择非化学计量水合物 2 进行临床研究。通过在原生介质中结晶相对容易获得。一般来说，质子溶剂有利于形成所需的水合物，即使在没有水的情况下也是如此。对于 2 个水合物，水合物中的水量取决于多晶型转变期间的含水量以及储存环境的相对湿度。然而，在标准相对湿度下通常很容易转化为一水合物。同样，MEK 溶剂络合物 2 可以通过在 40-45°C 的乙醇（15 体积）中搅拌 2-4 小时转化为所需的水合物。湿产物 2 冷却过滤后，在真空盘中干燥，很容易将乙醇含量降低到 0.5% 以下。在第一批临床中，最终结果是 844g 产品 2，纯度为 98.6%，收率为 96%。
虽然 2 可用于初始临床批次和早期研究，但它含有不溶性杂质，可能导致在肠外制剂中形成沉淀物。这些不溶性杂质主要在合成的磷酸化步骤中引入16。许多杂质是由 8 和其他副反应中存在的反应性杂盐（如乙酸盐、氢氧化物或磷酸单叔丁酯）反应引起的，包括 8 比 1 的水解。通常，8、16 和 2（以及其他相关中间体）被恶唑酮中间体（如图 3 所示）降解为 13，如图 2、图 3（降解途径）中提到。
图 4
因此，在最后一步中，通常会观察到低水平杂质的存在13，即 2 的降解产物。一个有趣的杂质是 17，它是在 8 降解成 13 以及未反应的 8 反应后产生的（图 3）。杂质 17 由于溶解性差，在配制过程中会析出，因此需要在过程中进行严格控制。通过酸脱保护获得 16 种 MEK 溶剂复合物后，大多数杂质得到了很好的控制（参见图 4 中的纯化因子）。最后 2 次转化为所需的水合物通常可有效去除杂质。
04
生产工艺的调整
表 6
在交付第一批临床样品后，制剂团队还担心 2 中存在不溶性杂质，尤其是二聚体样杂质17。2 中 MEK 溶剂复合物的分离纯化对 17 的净化因子约为 90%;但是仍然可以观察到 17 的存在，并且在肠外准备期间也可能出现沉淀。因此，对 8 合成 16 的步骤进行了深入研究，以试图了解所有杂质的过程根本原因，尤其是二聚体 17 的产生。对 17 的生成影响最大的工艺参数是溶剂的选择、碘化钠催化剂的当量和碘化钠催化剂的当量。与烷基化反应相比，使用太少的碘化钠更容易降解 8 至 13。如果浓度增加，8（或其碘化类似物）将优先与烷基化反应，而不是与 13 反应，形成二聚体杂质17（见图 3），从而减少 17 的形成。有趣的是，溶剂对 17 的形成有非常大的影响。通过将极性非质子溶剂（如 DMSO 或 DMF）与丙酮或 MEK 混合，烷基化反应是干净的，8 并且降解副产物也减少了，13 从而显著减少了二聚体杂质的产生17。如果单独使用 MEK 作为溶剂，生成 17 高达 5%，虽然将来获得 2 的 MEK 溶剂化合物后可以将 17 的含量降低到 0.5%，但小于 0.10% 的要求仍然达不到标准。通过将 DMF 更改为 DMSO，可以进一步降低 17 的含量。以MEK和DMSO为混合溶剂，纯度为16较高。作者还希望减少 DMSO 的总体积以简化合成物的后处理16，发现使用MEK与DMSO比例为85：15的混合溶剂时，反应中仅使用了17的约1%，而当获得2的MEK溶剂复合物时，17的含量已降低到0.1%。最终磷酸化步骤的最佳条件是在 25−35°C 下以 8 比 1.5 当量反应约 24 小时，以 0.2 当量 NaI 作为催化剂，以 1.5 体积的 DMSO 和 8.5 体积的 MEK 作为混合溶剂（见表 6）。
另一个问题是，在后一步使用 TFA 脱保护时，纯度波动很大，反应时间和温度不同，外消旋化和降解也不同。在研究了许多可以脱保护的酸之后，发现草酸是最有效的。在大约 10 体积的 MEK 中，在 50-60°C 下，可以在 6-12 小时内从叔丁基 16 中成功去除 5-6 等效的草酸。 这里的另一个优点是，前一个反应使用相同的溶剂 MEK。由于使用较温和的酸来去污丁基，许多副反应受到抑制。虽然 2−5% 的差向异构体仍正常产生，但在纯化 2 种 MEK 溶剂复合物时很容易降低到 0.2%，在纯化 2 种水合物时可以进一步降低到 0.1% 以下。对于叔丁基保护，需要将水分含量限制在 0.5% 以下，以尽量减少外消旋化和降解杂质的形成1。水分需要保持尽可能低的水平，这可以通过蒸馏 MEK 共沸除水来解决。16 在去污丁基去污丁基的过程中，异丁烯会在反应后 6-7 小时内缓慢释放，并与草酸、MEK 和残水反应。因此，长期反应和加热会产生不挥发的异丁烯相关副产物。在磷酸化和脱保护反应的最佳条件下，两步联合补料的产率为 64−72%，纯度为 99%。这些优化非常有益，当后期在不同的工厂进行生产时，可以获得非常相似的产量和纯度，说明工艺相对稳定，更宽容。在此过程中，获得 2 种 MEK 溶剂化合物后，所有杂质都可以控制在低于 0.20% 的水平。在随后 2 中的水合物纯化过程中，除脱氯杂质 8A 和甲酯 31 外，所有杂质均可进一步减少至 0.1% 以下（见图 4）。杂质 31 是由内酰胺 3 和 13 酰胺缩合产生。与旧工艺一样，MEK 溶剂复合物 2 的纯化效果非常好，但水合物的纯化效果一般（图 4）。
对于最后的结晶步骤，当最初使用乙醇作为溶剂时，水合物干燥过程很容易产生放大效应，具体取决于量级。此外，由于水合物2在该体系下的溶解度差，只能打浆而不能重结晶，除杂效果不是很明显。后来发现 MEK 和 MeOH 的混合溶剂是一种很好的选择。首先将 2 溶解在 4.5 体积的 MEK 中，此时 2 以 MEK 的溶剂络合物的形式存在，然后滴加 3 体积的 MeOH，即可直接获得 2 的水合物。2 在 MeOH 中的溶解度优于 EtOH，从而大大促进了晶体转移的速度。用溶解性好的甲醇，不仅结晶过程更稳定，而且去除杂质（主要是差向异构体和一些难以去除的杂质）也更好。转晶完成后，可加入2.5体积的MEK，以减少制浆母液中2的损失，同时，还需要保证甲醇的量不会太小而影响转晶效果（MeOH/MEK的体积比需大于20%）。与旧工艺一样，虽然通过干燥去除溶剂残留物更加困难，但它仍然比干燥乙醇容易得多。通过高流量氮气吹扫和高温 50−60°C 干燥解决了晶体干燥问题。在干燥过程中需要避免高温，因为 2 容易降解和外消旋化。即使在 50 至 60 °C 的工艺温度下，也存在外消旋化。在 55−60°C 下干燥 35 小时后，差向异构体的量从检测不到增加到 0.72%。
这点 2 的新合成路线（表 6）也几乎得到了优化，通过该工艺可以顺利获得临床批次所需的材料。但从商业生产的角度来看，仍然存在一些问题。水合物 2 的稳定性不好，常温下会降解为 1。从理论上讲，找到更稳定的溶剂化物或新的固体形式可能能够解决稳定性问题2。新路线的纯度得到了提高2，但从配方的角度来看，该工艺需要进一步优化，以确保在未来的商业化生产中能够更好、更严格地控制所有潜在的不溶性杂质。此外，13 和 5 的酰胺缩合得到的 8 纯度较差（杂质波动很大，总杂质含量为 3-6%），需要较温和的工艺合成 8。
05
内酰胺 3 合成路线的开发
图 5
内酰胺 3 的合成已在许多文献中报道，市场上也有大量的牌号。然而，在生产 3 上纯化需要一根柱（图 5）。在3的早期合成中，已经柱提纯，但当发现3纯度高时，可由二异丙醚结晶而来。因此，需要优化工艺，以找到无柱纯化3并提高产量（大多数步骤的产量较低）。
该工艺的第一步是在 −78 °C 下烯醇化 22，然后与溴乙腈立体选择性反应，得到含量为 75% 且 DR 值大于 99：1 的油状 23。烯醇化中间体的形成和淬火过程需要在严格的低温条件下进行，否则差向异构体杂质将大大增加。事实上，在间歇反应中，溴乙腈的进料温度要求非常高。溴乙腈的 THF 溶液需要预先冷却，并在液面下滴加。反应的淬灭也很关键，需要依次添加甲醇，然后添加有机酸（乙酸或柠檬酸效果很好）。在这种要求苛刻的批处理过程中，确保放大过程中的工艺稳定性是一项挑战。连续流反应器通常用于在醇化过程、烯醇化的烷基化过程和最终淬火过程中实现更好的温度控制。
后处理后得到的23溶液不精制，直接用于下一步反应。该反应以甲醇为溶剂，将腈基还原为胺，然后环合得到内酰胺 3。文献中已经报道了许多还原方法，包括 NaBH4/NiCl2、Pd/C、PtO2 和 NaBH4/CoCl2。对于传统的加氢，发现PtO2的效果优于Pd/C，但需要在酸性条件下进行，这导致在后续步骤中需要加入碱以释放中间体的胺，然后才能进行下一步的内酰胺环化。通过碱筛选发现，三乙胺、TMEDA、Hunig 碱和碳酸钠均引起一定程度的外消旋，而 DBU 和碱土金属碱则没有任何外消旋化。为避免反应后下一步的内酰胺环化和pH调节，最好在碱性或中性条件下氢化Raney Ni，可生成中间胺并原位环化成内酰胺。
图 6
在室温下，使用 5 bar 氢气与甲醇和 Raney Ni 2400 进行还原和循环化。然而，发现了内酰胺二聚体杂质26（图 6）。二聚体杂质可通过稀释 （25−30 mL/g） 或添加氨水或其他胺来控制。但是，如果使用氨、三乙胺或其他碱性添加剂，外消旋的风险会增加。因此，添加氨的量不应超过 1 当量。将反应温度降低到 5°C 也可以略微减少外消旋化，但被内酰胺氧化的吡咯杂质 29 会增加，氨的量也会增加到 2-10 当量。吡咯杂质 29 后期难以去除，因此需要严格控制其形成。最佳条件如下：在室温下进行 100% 重量的 Raney Ni 2400 反应，1 当量氨作为添加剂，5 bar 氢气和甲醇作为溶剂 （30 ml/g）。这种 Raney Ni 工艺大大降低了成本，但发现得有点晚，早期生产内酰胺 3 就是用老工艺做的。
作为加氢的替代方案，还开发了一种使用硼氢化钠和氯化钴进行还原的工艺。该过程与文献中报道的过程非常相似。具体工艺是加入 23， CoCl2（0.5−1.0 当量）、甲醇，冷却至 0 °C，然后分批加入硼氢化钠（4−6 当量）EtOH 溶液（或 THF 浆液）或硼氢化钠固体。通常使用六水氯化钴，但最好使用无水氯化钴以减少内酰胺二聚体 26 的形成。与氢化系统一样，溶剂稀释可以减少二聚体 26 的形成。向甲醇中添加极性较弱的溶剂（如乙醇、THF 或乙酸乙酯）也有助于减少内酰胺-二聚体杂质的量26。0−5°C 时还原反应较好，但内酰胺环化反应相对较慢，反应后期需要将温度升至 10−25°C 才能完成。虽然使用硼氢化钠的乙醇溶液似乎相对安全（即使在环境条件下也具有最小的反应性），但当系统仍处于碱性状态时（酸淬之前），仍会发生酯交换反应，并且需要将反应时间保持在最低限度。更好的选择是使用 THF 和甲醇作为混合物。由于甲醇与硼氢化钠发生反应，作为溶液使用不安全，但硼氢化钠可制成THF浆料或低温分批放入23和CoCl2的甲醇溶液中。虽然早期生产中使用了硼氢化钠和 CoCl2 的还原工艺，但建议在后期生产中使用 2400 工艺，以提高产量并降低安全风险。
无论使用何种还原方法，粗内酰胺 3 都不容易结晶。作者研究了多种纯化和结晶内酰胺的方法，包括酶促转化和共晶。在尝试共晶和 3 的盐时，发现盐 25 可以通过 deboc 与酸一起获得，使其更容易结晶和纯化。对甲苯磺酸盐是最佳选择，很容易从甲醇或异丙醇结晶。原料使用还原方案（Raney Ni 或 NaBH4/CoCl2）获得，后处理后，可以通过蒸馏 进行共沸干燥，以降低水分含量并避免酯的皂化（水解）反应。最后，将无水对甲苯磺酸（对甲苯磺酸也需要用 iPrOH 共沸脱水）添加到 iPrOH 溶液中以保护 deBoc。通常需要加热到 45−55oC 才能使 Boc 裂解并转化为对甲苯磺酸盐25。为了提高产量，可以添加 MTBE、EtOAc 或作为助溶剂。使用 NaBH4/CoCl2 方案，将 23 个减少、环化、脱保护并盐化至 25 个，总产率为 35-45%。在 Raney Ni 还原过程中，这些步骤的总收率可以提高到 50-60%。
通常，酰胺二聚体杂质 26 的量为 5-25%，但经 25 结晶分离的杂质量减少到 2% 以下（图 6）。许多其他杂质，如差向异构体、未反应的中间体27、乙酯杂质28、酯水解杂质30等，也可以控制在0.25%以下。唯一的例外是氧化杂质29，它们在结晶过程中难以去除25，在反应过程中需要控制在 0.25% 以下。
06
开发商业生产路线
图 7
表 7
提高纯度8更为迫切，因为随着后期临床需求的增加，对中间体8的需求也在增加。如前所述，纯度为8的可由5的提纯解决，由5制成的对甲苯磺酸盐可结晶提纯。但是，当甲苯磺酸盐5（图7）酰胺化并与13缩合时，反应效果较差，可能是因为5-对甲苯磺酸盐的溶解度差，13更容易形成噁唑酮中间态，形成杂质。此外，5 易受两个分子之间的加成和脱水形成二聚体杂质的影响（图 7）。这种过程的风险太大，商业生产后设备质量和传热的变化会使杂质难以控制，尤其是对于异质系统。出乎意料地发现，杂质 25 in 5 很容易与 13 缩合得到杂质 31。这表明底物 25 在该系统中可以很容易地与酰胺缩合（表 7）。
因为甲苯磺酸盐 25 也有可能很好地结晶，所以考虑使用 25 而不是 5 和 13 进行酰胺缩合（表 7）。当比较 5 和 25 的酰胺缩合反应时，发现 25 反应效果良好，与 13 的反应可以顺利得到 31。溶剂（MEK 或丙酮）和酰胺化条件（EDCI 和 HOPO）对外消旋化程度也有很大影响。以MEK为溶剂，用1.25当量EDCI、0.25当量HOPO和2.5当量二异丙乙胺在室温下放置6h，产物31的dr值为96：4，反应转化率>99%，工艺非常稳定。后处理后，31 的溶剂络合物可以用 MTBE 或 2-MeTHF 结晶，收率为 80-85%。由于该工艺得到的 31 粗品纯度高，可以考虑直接共同投资下一步，无需精炼。
为了获得关键中间体8,31，需要用氯乙酸类似物进行氯甲基化，就像之前用内酰胺 3 进行的 反应一样。尝试用氧化氢叶斋与丙二酸或氯乙酸或其酯的加成反应，但效果不佳，氯乙酸的烯醇化镁盐除外。31 有四种活性氢，氯乙酸也被去质子化和烯醇化，最初需要 20 个当量，后来优化为 12-14 个当量。为了尽量减少脱氯杂质的形成，有必要使用叔胺作为镁盐的配体。三乙胺效果良好（脱卤杂质为 7-10%）。如果使用 N-甲基哌啶或 N-甲基吡咯烷，脱卤杂质可降至 5% 以下。对于脱卤杂质，由于不易原位脱羧，因此在后处理过程中可以用温和的碱去除所得的β-酮酸杂质。当然，低温也可以减少脱羧杂质的产生。因此，加羧和脱羧的最佳条件是：在室温下，将31和1.5当量的氯乙酸缓慢加入到12当量和5当量N-甲基哌啶的THF溶液中，转化率大于97%，脱卤杂质在3%左右，其他杂质减少很多。在 100-250 kg 时，8 的产量为 60-75%，纯度为 95-98%。
在早期开发过程中，可以乙酸乙酯、MTBE 或 2-MeTHF 溶剂络合物的形式获得 8，但物理性能较差。对于这些溶剂化合物，杂质去除并不理想，但差向异构体可以很好地去除。只要 8 的 DR 值高于 85：15，就可以将溶剂复合物中的差向异构体量控制在非常低的水平。后来，还发现 8 的 2-MeTHF 溶剂络合物非常稳定（不易脱溶剂化）并且具有良好的物理性质（高堆积密度）。由于 8 的纯度低 （90-94%）、堆积密度低且难以处理，为了获得良好的 8 的 2-MeTHF 溶剂络合物，必须用 2-MeTHF 与 iPrOH 或水的混合溶剂结晶。用水作为溶剂混合物不是很好，因为只有在非常狭窄的范围内，足够的水才能获得所需的 2-Me-THF 溶剂络合物，而过多的水会导致 2-MeTHF 溶剂络合物的晶体溶解。2-MeTHF 和 iPrOH 作为混合溶剂更有效（2-MeTHF 和 iPrOH 的体积比大于 25%），可以更容易、更稳定地获得所需的晶型。众所周知，化学纯度是获得所需晶型的关键因素。如果 8 的纯度不足，则需要用甲醇或异丙醇重结晶以提高纯度，然后在 2-MeTHF 和 iPrOH 的混合溶剂中结晶，将 8 转化为所需的 2-MeTHF 溶剂络合物。
解决了 8 的纯度问题后，更容易通过磷酸化和脱保护合成合格的 2。尽管如此，希望进一步提高 2 的质量，并找到一种易于储存和使用的优质 2 溶剂络合物。此外，2 易受水合物中残留水的水解而产生杂质 1。2 水合物常温下，保质期不超过一个月，冷藏保质期可为 1-2 年。如果其他晶型能够储存并保持稳定多年就更好了。除了 2 水合物的储存稳定性外，2 MEK 溶剂络合物的稳定性也是一个问题，长期储存过程中会损失部分溶剂。
表8
在各种溶解和重结晶尝试中2，发现溶解在 DMSO 中并用 MEK 或 iPrOH 结晶会导致产生新的晶型。尽管推测使用 MEK 作为反溶剂可能会产生 2-DMSO 溶剂，但实验结果表明，新的多晶型物是 2 的 DMSO 溶剂复合物。当存在 DMSO 时，无论使用 iPrOH 作为反溶剂还是这三种混合溶剂，获得的结晶形式都是 2 的 DMSO 溶剂络合物。DMSO 溶剂复合物相对稳定，可在室温下储存。对于在环境条件下降解 12 周的 2 种水合物，在相同的降解条件和时间下，2 种 DMSO 溶剂化合物的杂质 1 含量在 0.3% 和 0.4% 之间，杂质 1 的含量低于 0.05%。在冷藏条件下，DMSO 溶剂复合物 2 的保质期预计至少为 3-4 年。由于 2 的降解对后端注射制剂影响很大，因此 2 的更稳定的 DMSO 溶剂复合物对 2 的供应和储存非常有帮助。除了良好的化学稳定性外，这种 2 的 DMSO 溶剂络合物还具有药物所需的其他一些物理化学性质。例如，几乎所有与工艺相关的和降解的杂质都被很好地去除，溶剂化物的高稳定性（其他形式容易损失溶剂），优异的堆积密度和流动性。2的水合物晶型为针状，堆积密度通常为0.2 g/mL左右，而2的DMSO溶剂络合物晶型为板状或棒状，堆积密度为0.3-0.4 g/mL。
由于已知 2 的 MEK 溶剂络合物在环境条件下储存数个循环时会损失部分溶剂，因此在合成 2 的 MEK 溶剂络合物时可以考虑添加 DMSO，将其直接转化为稳定的 DMSO 溶剂络合物。因此，当尝试用草酸对 MEK 中的 16 进行脱保护时，直接加入 DMSO，得到 2.然而，2 在 MEK 和 DMSO 的混合溶剂中溶解度高，导致结晶过程中母液损失较大。然而，在室温下，将 2 的 MEK 溶剂复合物溶解在约 2 体积的 MEK 和约 1 体积的 DMSO 中，并加入约 15 体积的 iPrOH 作为抗溶剂，得到 2 的 DMSO 溶剂复合物，产率约为 83-90%（表 8）。通过可靠的重结晶工艺2，所有杂质和内毒素都得到很好的控制，并且 DMSO 溶剂复合物 2 可以长期储存。
表 9
07
总结
作者开发了一种稳定的合成工艺，用于合成内酰胺 25 的甲苯磺酸盐，并以高产率8合成，其中与工艺相关的杂质控制良好，为大规模生产铺平了道路2（表 9）。随后的烷基化和脱保护步骤也有助于稳定生产。最后，在 2 中发现 DMSO 溶剂络合物为工艺提供了一种稳定的中间体，便于长期储存，并具有优异的物理化学性质，也为工艺相关杂质的控制提供了重要的纯化方法。通过制备 2 个 MEK 溶剂络合物，然后制备 2 个 DMSO 溶剂络合物，所有工艺相关杂质都可以很好地控制在 0.1% 以下，很好地保证了后端注射制剂工艺不会出现问题。最后，经过多晶型转化，获得所需的水合物 2。从 8 到 8,2 的水合物总产量为 54%，纯度为 99.5-99.8%，比例为 30-40 kg。
✎ 引用
【1】;大卫;亚当·布朗;加里 M. ;等 Org. Res. Dev.2023，尽快。
过去推荐
发现一种潜在的高选择性 NLRP3 拮抗剂 （GDC-2394）。
[制药技术平台].
【制药技术平台】基于片段化合物的药物发现 （FBDD）。
【合成进展】邻位锂化技术用于扩展Boc保护的环胺
关于药石科技
药石科技股份有限公司（股票代码：药石科技）是全球医药研发和制造业创新产品和服务的一站式提供商。公司始终致力于通过在研发和生产过程中的化学和低碳技术创新，帮助合作伙伴提高新药发现和开发的效率，并全速推进项目启动进程。自 2008 年成立以来，药石科技已与几乎所有世界排名前 20 的制药公司和数百家中小型生物技术公司合作。
药石科技凭借其新颖独特的分子构建模块和相关化合物库筛选技术促进药物发现。同时构建一体化CMC平台，为创新药研发和商业化项目的中间体、原料药和药物制剂提供高效、高质量的工艺开发和生产服务。同时，公司整合多年在连续流化学、微填充床技术、催化技术、智能制造等前沿技术方面的能力积累，积极探索生物医药领域绿色、安全、智能的先进制造和服务模式，推动行业创新发展。
公司官网：
产品网站：
联系我们
南京明石科技有限公司
地址：江苏省南京市江北新区华盛路81号
邮政编码：
电话：+86-
传真： +86-25
电子邮件：
（美国）， Inc.
地址： 777 Road，Unit D，， PA 19440， USA
电话：+1-877 878 5226 / 267 649 7271
传真： +1-267 222 7551
电子邮件：