一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化连续催化的方法
1.本发明属于酶催化领域，具体涉及一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化及连续催化方法。
背景技术：
2. 在工业生物催化中，生物催化剂
‑
酶在生物工业催化过程中起着重要作用，它在催化上具有很强的选择性，可以形成复杂的化学产物，在生产和回收利用中发挥着不可比拟的作用。酶的种类越来越多，其功能也是多种多样的，但迄今为止发现的酶中，50%是辅因子依赖性酶。辅因子（）是指与酶结合的必需成分，是催化反应所必需的非蛋白质化合物。在工业催化过程中，辅因子依赖性酶需要额外的辅因子来催化或促进催化反应，但辅因子一般价格昂贵，额外添加会增加生产成本，固定化酶技术已经比较成熟，但辅因子等小分子的回收仍比较困难，回收辅因子成为研究者们研究的热点。
3. 含有磷酸基团的辅因子，如5
‑
磷酸吡哆醛 (PLP)、氧化辅酶 NAD
, 核苷酸时尚
、ATP等是生物体内重要的辅因子，参与生物体的生命活动。带有磷酸基的辅因子使其带负电荷，这些辅因子能可逆地结合在带正电荷的物质表面，能有效地保留在固定化催化体系中，并能与酶的活性中心结合发挥催化作用。根据其性质，
‑
等以聚乙烯亚胺修饰琼脂糖凝胶珠为载体材料制备固定化微球，并将制备好的固定化辅因子与
和甲酸脱氢酶，辅因子 plp 和 w
‑
转氨酶，无需加入PLP即可实现连续催化。
我
特兹
‑
等还利用聚乙烯亚胺改性树脂微球共固定w
‑
转氨酶实现了PLP的自给自足利用，这些固定化材料需要有机试剂聚乙烯亚胺对材料进行改性，与目前提倡的绿色可持续发展不符，因此有必要开发易于获取、绿色可持续的固定化材料，利用材料实现辅因子和酶的固定化具有重要意义。
4.l
‑
赖氨酸脱羧酶（L
‑
) 是一种辅助因子 plp 依赖性酶，可催化
‑
赖氨酸脱羧生成1分子戊二胺和1分子CO2，目前工业生产中需要额外添加PLP才能实现高效催化反应，但该工艺大大增加了生产成本，目前专利CN2.9已实施
‑
赖氨酸脱羧酶被重复使用，但辅因子PLp未被固定化，在连续反应中需要额外的PLp来实现催化。
技术实现要素：
5、针对现有技术的不足，本发明提供了一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化及连续催化的方法，其中利用易得可再生的甲壳素，通过脱乙酰基预处理，作为固定化材料，对辅因子与其相应的依赖性酶进行共固定化研究，在五亚甲基二胺连续催化合成的应用中，可以有效防止plp的流失，提高辅因子及其相应的依赖性酶的催化效率，实现辅因子的循环利用。
6、为解决现有技术的问题，本发明所采用的技术方案是：一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化及连续催化方法，包括以下步骤：
步骤1、固定化材料的制备取几丁质材料0.5
‑
将 10 g 混合物加入 100 ml 蓝瓶中，加入脱乙酰试剂，置于 0
‑
放入100°C水浴中搅拌0.1
‑
72小时后得到不同的脱乙酰基几丁质；通过过滤或离心除去脱乙酰基试剂，用清水洗至中性；干燥备用；步骤2，先固定化辅因子，再固定化辅因子依赖性酶；或先固定化辅因子依赖性酶，再固定化辅因子，得到共固定化催化剂；步骤3，共固定化催化剂的连续催化应用，将共固定化催化剂置于ep管中，加入0.5
‑
反应中使用50 g/l底物，pH 5.5
‑
9.0,25
‑
60℃反应10
‑
60min；检测底物残留及产物生成，计算转化率，离心去上清，再加入底物进行下一批反应，整个过程无需添加任何额外的辅因子。
7. 作为改进，辅因子为 5
‑
磷酸吡哆醛（
‑5'ꢀ
，plp)，则相应的辅因子依赖性酶为plp依赖性酶，或者辅因子为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（，nad+)，则相应的辅因子依赖性酶为nad+依赖性酶。
8、进一步的改进是，在辅因子依赖性酶的碳端或氮端融合几丁质结合域（CHBD）作为标签，使辅因子依赖性酶能够吸附结合到固定化材料上进行固定化。
9. 进一步的改进是将辅因子plp固定化，然后
‑
固定化赖氨酸脱羧酶的步骤如下：固定化辅因子plp，然后
‑
赖氨酸脱羧酶的固定化步骤如下：步骤1中获得的0.01%壳聚糖
‑
将 1 g 加入 2 ml EP 管中，然后加入 0.5
‑
2毫升0.01
‑
将 1 mM 辅因子 PLP 溶液加入转子中，在冰上搅拌 1
‑
5 h使PLP充分吸附,离心收集沉淀,再用蒸馏水洗涤沉淀,除去游离的PLP,辅因子PLP吸附在材料表面,完成固定化辅因子PLP材料的制备;取l
‑
赖氨酸脱羧酶的制备
‑
将1 ml蛋白质浓度为3.5 g/l的上清液加入到含有固定化材料的2 ml EP管中，以200 rpm搅拌10分钟。
‑
样品离心30 min，使酶特异性吸附于材料表面，离心收集上清液后，用1 mol/L氯化钠洗涤3次，除去游离蛋白，再用PBS洗涤3次，除去氯化钠溶液。
‑
获得了赖氨酸脱羧酶和辅因子plp。
10. 进一步的改进是首先执行 l
‑
固定化赖氨酸脱羧酶，再固定辅因子plp。具体步骤如下：首先，
‑
固定化赖氨酸脱羧酶，再固定化辅因子plp，具体步骤为：将步骤1得到的脱乙酰化几丁质0.01加入到
‑
将 1 g 加入 2 ml EP 管中，取 l
‑
赖氨酸脱羧酶的制备
‑
3.5 g/l 蛋白浓度上清液 1 ml，加入转子 200 rpm 搅拌 10
‑
酶特异性吸附在材料表面30 min，离心去上清，收集沉淀，加入1 M氯化钠洗涤沉淀三次，去除游离蛋白，再用PBS洗涤三次，去除氯化钠溶液，收集沉淀，加入0.5
‑
2 毫升 0.01
‑
加入1 mM 辅因子 PLP 溶液，在冰上搅拌 1 小时。
‑
5小时后plp充分吸附,离心收集沉淀物,再用蒸馏水洗涤,除去游离的plp,辅因子plp吸附在材料表面,得到共固定化l
‑
获得了赖氨酸脱羧酶和辅因子plp。
11、作为改进，步骤1中所述的几丁质材料来源于虾壳、蟹壳或真菌菌丝体。
12.作为改进，步骤1中所述的甲壳素材料为粉末、纳米纤维、纳米球、颗粒、凝胶膜或凝胶球。
13.作为改进，所述脱乙酰剂为氢氧化钠、氢氧化钾或几丁质脱乙酰酶。
14、有益效果： 与现有技术相比， 本发明的辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化及连续催化方法具有以下优点：
1.该方法是首次采用天然高分子材料甲壳素及其脱乙酰基衍生物共固定酶和辅因子plp的新方法；2.本发明所采用的甲壳素材料是一种天然高分子材料，绿色、可降解，符合当前绿色可持续发展理念；3.本发明的固定化材料制备简单，该共固定化方法可扩展性好。
附图的简要说明
15.图1是激光共聚焦显微镜图像，其中（a1）是400倍放大图像，显示未激发材料的表面，（a2）是405nm波长激发PLP图像，表明PLP固定在材料表面。（a3）是与固定在488nm波长的绿色荧光蛋白融合的cada
‑
chbd图显示酶也固定在材料表面；（a4）是（a2）和（a3）的重叠，表明plp和l
‑
成功实现了赖氨酸脱羧酶的共固定化。
16. 图2展示了不同脱乙酰度（ddA）材料的共固定化
‑
赖氨酸脱羧酶和辅因子 PLP 依次催化转化率。
具体实施方案
17、实施例1步骤1、称取100目几丁质颗粒1g于100ml蓝口瓶中，加入100ml 20％氢氧化钠溶液，将蓝口瓶置于90℃水浴中，搅拌2小时后，取出；得30％脱乙酰基几丁质；抽滤除去碱溶液，水洗至中性，干燥备用；步骤2、称取0.01g 30％脱乙酰基几丁质于2ml EP管中匀浆，加入0.5ml 0.1mM辅因子PLP溶液，置于转子中，冰上搅拌1h，使PLP充分吸附，离心收集沉淀，再用蒸馏水洗涤，除去游离PLP。 因子plp吸附在材料表面，完成固定化辅因子plp材料的制备；步骤3，制备1.72g/lc
‑
几丁质结合域终止
‑
赖氨酸脱羧酶粗酶液上清液蛋白浓度（l
‑
赖氨酸脱羧酶spldc
‑
chbd，5 OD细胞破碎，离心取上层液体）1 ml加入收集沉淀的管中，加转子搅拌30分钟，使酶特异性吸附在材料表面，离心收集上清后，加入1 M氯化钠沉淀洗涤3次，再用PBS洗涤3次，即得共固定化材料；步骤4，取步骤3中的共固定化材料，加入50 g/l底物l
‑
赖氨酸在pH 6.0、37℃条件下反应10 min，离心去上清后加入底物进行下一批反应，全程不加入外源辅因子PLP，该批反应重复5次。检测
‑
根据生成的残留赖氨酸和戊二胺的量计算各批反应的转化率，第五批反应的转化率为29％。
18.spldc
‑
CHBD 氨基酸序列：PGE
实施例2 步骤1、称取3g 100目几丁质颗粒于100ml蓝瓶中，加入100ml 30%氢氧化钠溶液，将蓝瓶置于90℃水浴中，搅拌2h后取出；得36%脱乙酰几丁质；抽滤除去碱溶液，用水洗至中性pH值，60℃干燥备用；步骤2、称取0.01g 36%脱乙酰几丁质，将乙酰几丁质加入2ml EP管中，再加入1ml 0.1mM辅因子PLP溶液，加转子冰上搅拌1h，使PLP充分吸附，然后离心收集沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀，除去游离plp，辅因子plp吸附在材料表面；步骤3、制备的1.72g/lc
‑
几丁质结合域终止
‑
赖氨酸脱羧酶蛋白浓度：粗酶液上清液1ml（l
‑
赖氨酸脱羧酶Cada
‑
chbd,5 OD细胞破碎,离心,取上层液体,其中l
‑
赖氨酸脱羧酶Cada
‑
chbd来源与cn2.9相同)加入到收集沉淀的管中，用转子搅拌30分钟，离心去上清，用1M氯化钠洗涤沉淀三次，除去游离蛋白，用PBS洗涤三次，除去氯化钠溶液，得到共固定化材料；步骤4，取步骤3中的共固定化材料，加入50g/l的底物l
‑
赖氨酸在pH 6.0、37℃条件下反应10 min，离心去上清后加入底物进行下一批反应，全程不加入外源辅因子PLP，该批反应重复5次。检测
‑
根据生成的残留赖氨酸和戊二胺的量计算各批反应的转化率，第五批反应的转化率为49％。
19.cada
‑
chbd氨基酸序列： 实施例3 步骤1、取100目几丁质颗粒3g加入到100ml蓝口瓶中，加入40％氢氧化钠溶液100ml，将蓝口瓶置于90℃水浴中，搅拌2h后取出；得40％脱乙酰几丁质；滤出碱溶液，用清水洗至中性，60℃烘干备用； 步骤2、称取40％脱乙酰几丁质0.01g加入到2ml ep管中，再加入1ml 0.1mm辅因子plp溶液，随后将管置于转子中，在冰上搅拌1h，使plp充分吸附，然后离心收集沉淀，然后用蒸馏水洗涤沉淀，除去游离的plp。 将辅因子plp吸附于材料表面，制备固定化辅因子plp材料。
6.0，37℃反应10分钟；离心去上清后加入底物进行下一批反应，全程不加入外源辅因子plp；连续重复该批反应5次，l
‑
根据残余赖氨酸和生成的戊二胺量计算各反应批次的转化率，第五次反应的转化率为90％。
22.综上所述，本发明提供了一种辅因子及辅因子依赖性酶的共固定化及连续催化的方法，其中利用来源广泛、易得、可再生的几丁质，通过脱乙酰基预处理，作为辅因子plp及l的固定化材料
‑
赖氨酸脱羧酶的共固定化可以有效防止五亚甲基二胺连续催化合成过程中plp的损失,并提高辅酶plp和l的含量。
‑
提高赖氨酸脱羧酶的催化效率，实现辅因子PLP的循环利用。
技术特点：
1.一种用于连续催化的辅因子和辅因子依赖性酶的共固定化方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1、固定化材料的制备：0.5
‑
将 10 g 混合物加入 100 ml 蓝瓶中，加入脱乙酰试剂，置于 0
‑
放入100°C水浴中搅拌0.1
‑
72小时后得到不同的脱乙酰基几丁质；通过过滤或离心除去脱乙酰基试剂，用清水洗至中性；干燥备用；步骤2，先固定化辅因子，再固定化辅因子依赖性酶；或先固定化辅因子依赖性酶，再固定化辅因子，得到共固定化催化剂；步骤3，共固定化催化剂的连续催化应用，将共固定化催化剂置于ep管中，加入0.5
‑
反应中使用50 g/l底物，pH 5.5
‑
9.0,25
‑
60℃反应10
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60min；检测底物残留量及产物生成量计算转化率，离心去上清，再加入底物进行下一批反应，整个过程不需额外添加辅因子。2.根据权利要求1所述的一种辅因子及辅因子依赖型酶的共固定化及连续催化方法，其特征在于在辅因子依赖型酶的碳端或氮端融合几丁质结合域作为标签，可使辅因子3.根据权利要求1所述的一种辅因子及辅因子依赖型酶的共固定化及连续催化方法，其特征在于辅因子为5
‑
磷酸吡哆醛，相应的辅因子依赖性酶为PLP依赖性酶，或辅因子为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，相应的辅因子依赖性酶为NAD
4.根据权利要求3所述的辅因子及辅因子依赖性酶的共固定化及连续催化方法，其特征在于：将辅因子plp固定化后l
‑
固定化赖氨酸脱羧酶的步骤如下：固定化辅因子plp，然后
‑
赖氨酸脱羧酶的固定化步骤如下：步骤1中获得的0.01%壳聚糖
‑
将 1 g 加入 2 ml EP 管中，然后加入 0.5
‑
2毫升0.01
‑
将 1 mM 辅因子 PLP 溶液加入转子中，在冰上搅拌 1
‑
5 h使PLP充分吸附,离心收集沉淀,再用蒸馏水洗涤沉淀,除去游离的PLP,辅因子PLP吸附在材料表面,完成固定化辅因子PLP材料的制备;取l
‑
赖氨酸脱羧酶的制备
‑
将1 ml蛋白质浓度为3.5 g/l的上清液加入到含有固定化材料的2 ml EP管中，以200 rpm搅拌10分钟。
‑
样品离心30 min，使酶特异性吸附于材料表面，离心收集上清液后，用1 M氯化钠洗涤3次，除去游离蛋白，再用PBS洗涤3次，除去氯化钠溶液。
‑
5. 根据权利要求 3 所述的辅因子及辅因子依赖性酶的共固定化及连续催化方法， 其特征在于： 首先，
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固定化赖氨酸脱羧酶，再固定辅因子plp。具体步骤如下：首先，
‑
固定化赖氨酸脱羧酶，再固定化辅因子plp，具体步骤为：将步骤1得到的脱乙酰化几丁质0.01加入到
‑
将 1 g 加入 2 ml EP 管中，取 l
‑
赖氨酸脱羧酶的制备
‑
3.5 g/l 蛋白浓度上清液 1 ml，加入转子 200 rpm 搅拌 10
‑
酶特异性吸附在材料表面30 min，离心后收集沉淀，去上清，加入1 m氯化钠溶液洗涤沉淀3次，去除游离蛋白，再用PBS洗涤3次，去除氯化钠溶液，收集沉淀，加入0.5
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2 毫升 0.01
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加入1 mM 辅因子 PLP 溶液，在冰上搅拌 1 小时。
‑
5小时后plp充分吸附,离心收集沉淀物,再用蒸馏水洗涤,除去游离的plp,辅因子plp吸附在材料表面,得到共固定化l
‑
6. 根据权利要求 1 所述的一种辅因子及辅因子依赖型酶的共固定化及连续催化方法， 其特征在于， 步骤 1 中所述的材料为几丁质材料， 来源于虾壳、 蟹壳或真菌菌丝体。 7. 根据权利要求 1 所述的一种辅因子及辅因子依赖型酶的共固定化及连续催化方法，
其特征在于步骤1中所述的几丁质材料为粉末、纳米纤维、纳米球、颗粒、凝胶膜或凝胶球；8、根据权利要求1所述的辅因子及辅因子依赖性酶的共固定化连续催化方法，其特征在于所述的脱乙酰化剂为氢氧化钠、氢氧化钾或几丁质脱乙酰酶。
技术摘要
本发明公开了一种辅因子与辅因子依赖性酶的共固定化及连续催化的方法，该方法是通过对几丁质进行部分脱乙酰化，通过电荷作用将辅因子固定化，将几丁质结合域与辅因子连接，通过辅因子依赖性酶的融合表达，实现对几丁质进行部分脱乙酰化，形成共固定化催化剂，无需添加额外的辅因子，即可达到良好的重复使用效果，连续使用五次后，在最佳条件下，转化率仍可维持在60%
技术研发人员：陈克全、魏国光、张阿雷、周宁、陈岩、刘鑫、王子豪、韦龙辰、欧阳平凯
受保护技术用户：南京工业大学
技术开发日：2021.08.18
技术发布日期：2021/11/8