犬细小病毒最新研究成果综述
【摘要】：犬细小病毒(CPV)是引起犬急性胃肠炎的主要病原体之一。典型的临床症状包括呕吐、发烧和腹泻。通常 6 周至 6 个月大的小狗更容易受到感染。 CPV-2于20世纪70年代末出现后，现已在全世界流行。病原学研究表明，CPV基因组替换率与RNA病毒相似，基因组多个位点出现新突变，与病毒发病机制密切相关，引起科研人员的广泛关注。在检测方面，多重聚合酶链反应（PCR）、聚合酶链扩增阻碍突变系统（ARMS-PCR）、绝缘等温PCR（PCR、iiPCR）、高分辨率熔解曲线PCR（高分辨PCR、PCR-HRM）、侧流层析试纸技术（-loop-flow，IC-LAMP-LFD）、聚合酶螺旋反应（，PSR）、重组聚合酶扩增方法（，RPA）、液体悬浮芯片使用系统（xTAG）和免疫层析（ IC），我们在防控方面开展了核酸疫苗、重组亚单位疫苗、病毒样颗粒等新型疫苗和治疗药物的研究。本文综述了CPV的流行病学、病原学、检测方法和防治措施。
关键词：犬细小病毒；流行病学；发病;检测方法；疫苗;
：（CPV）是狗的主要急性病毒之一。症状，发烧，。 ，年龄6周至6岁已发现更多的CPV。研究认为CPV-2及其后的CPV-2是在20世纪70年代后期出现的。研究表明，CPV 率与 中具有位点的 RNA 的比率相同。
中，新人来到了CPV。 PCR、(ARMS-PCR)、PCR(iiPCR)、高-PCR(PCR-HRM)、-loop-flow (IC-LAMP-LFD)、(PSR)、(RPA)、xTAG 测定和 (IC) 。 ，就比如酸，还有病毒样和药物都被淘汰了。
这是针对 CPV 的。中、上、、和CPV均在此。
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犬细小病毒（CPV）是犬科动物最常见、危害最大的病毒致病因子之一，是肉食动物细小病毒的典型代表。 CPV 对 2 个月至 4 个月大的小狗危害最大。典型的临床表现包括呕吐、发烧、腹泻和脱水。通常病犬很难治愈，发病率和死亡率高达70%，对犬只的健康造成很大危害，给犬只养殖业带来重大损失。 CPV的基因组替换率与RNA病毒相似[1]。最近的研究表明，多个位点出现了新的突变，引起了科研人员的广泛关注。随着研究的不断深入，在检测方法、流行状况、致病机制、疫苗研制等方面都取得了新进展。因此，本文对国内外近期研究取得的新进展进行总结和阐述，以期为后续CPV防控提供参考。
一、病毒来源
犬细小病毒2型（CPV-2）是1977年由美国学者He从病犬粪便中分离出来的。经过研究发现，来源于猫细小病毒（FPV）部分氨基酸位点的突变。 CPV-2在DNA水平上与犬细小病毒（MVC或CPV-1）具有较低的同源性。 1982年，我国梁士哲等报道了疑似CPV引起的犬出血性肠炎病例。后来，1983年，徐汉坤等人证实该病已在我国流行。自CPV被发现以来，已有约40年的历史。在此期间，新的基因型和突变位点不断出现。目前，该病毒已在全球广泛传播。该病的预防主要依靠灭活疫苗或减毒活疫苗，但抗原变异体的出现以及母源抗体的影响在一定程度上引发了人们对商业疫苗有效性的质疑[2]。
2. 受欢迎的地位
自20世纪70年代末发现CPV感染以来，该病已在美国、日本、比利时、法国、丹麦和澳大利亚迅速传播[2]。目前，全球至少有50多个国家报告了CPV感染，其中大多数存在多种不同基因型的感染。北京、湖北、江苏、四川、甘肃、上海、黑龙江、吉林、辽宁、河北、山东等地已开展流行病学研究，我国已报告所有基因型[3]。 CPV有多种宿主，在狼、狐狸、猫、老虎、浣熊、熊、水獭、豺狼、豹子和果子狸中均检测到该病毒（部分报道基于血清学检测）[2]。对于从这些宿主中分离病毒序列的分析可以帮助发现潜在的抗原变异。
3.病因学
3.1.病毒的基本特征
CPV属于细小病毒科()、细小病毒亚科()，是典型的细小病毒属(Genus)的成员。它是一种小型、无包膜的单链DNA病毒[3]。病毒颗粒具有正二十面体对称结构，由60个结构蛋白组装而成，直径约为25 nm。
3.2.基因组结构
CPV基因组DNA全长约5.2 kb，包含2个开放阅读框（ORF），分别编码2个非结构蛋白（NS1和NS2）和2个结构蛋白（VP1和VP2）。 P4启动子的早期转录和翻译形成两种非结构蛋白NS1和NS2。 NS1编码基因全长2 007 bp，编码668个氨基酸残基。 NS1蛋白可以影响病毒复制并触发途径依赖性细胞凋亡[4]。 NS2编码基因长531bp，编码176个氨基酸残基。 NS2蛋白可以促进病毒的释放，也可以为NS1的功能提供辅助作用。 P38启动子的晚期转录和翻译形成两种结构蛋白：VP1和VP2。 VP1编码基因全长2 181 bp，编码726个氨基酸残基。病毒衣壳中大约有 5 至 6 个该蛋白质的拷贝。 VP2编码基因全长1 755 bp，编码584个氨基酸残基。与VP1蛋白相比，其N端缺少143个氨基酸残基。 VP2是病毒衣壳的重要组成部分，病毒衣壳中大约有54至55个拷贝。 VP2 包含主要抗原决定簇，以及决定宿主范围的关键位点和宿主细胞膜上转铁蛋白受体 (TfR) 的结合位点 [5]。病毒衣壳组装完成后，通过切割和降解VP2蛋白的N端10至15个氨基酸残基形成VP3蛋白，VP2蛋白仅在完整的感染性病毒颗粒中产生。
3.3.病毒分型和突变株
CPV-2源自FPV的一些氨基酸位点的突变。与FPV相比，VP2对应的位点变化为、、、、、。病毒经过不断进化，除原有的CPV-2外，还包括5种抗原：CPV-2a、CPV-2b、New CPV-2a、New CPV-2b和CPV-2c。与CPV-2相比，CPV-2a中VP2相应位置的氨基酸残基变化为、、、。与CPV-2a相比，CPV-2b主要改变了VP2中的氨基酸残基。与CPV-2b相比，CPV-2c的VP2氨基酸残基发生了变化。与CPV-2a/2b相比，New CPV-2a/2b在VP2的氨基酸残基上发生了变化[2]。值得注意的是，自2000年在意大利首次发现CPV-2c以来，该病毒已在美国、德国、希腊、阿根廷和比利时被发现[2]。该型病毒于2010年在我国首次检测到，2014年成功分离出CPV-2c病毒。近年来有文献报道吉林省有样本检测出CPV-2c阳性（2010年） ，北京（2014），山东（2014），河南，广西和江苏（2015/2016）[1]。除了上述相关位点的变化可用于区分不同抗原类型外，VP2相应位点的氨基酸残基也有变化，如、、、、、、等。近年来，人们发现了VP2中一些新的氨基酸残基变化，包括、、、、、、和[6]、、、和[7]。有研究指出，位于VP2蛋白300位的氨基酸残基的变化可以影响病毒与转铁蛋白受体（TfR）的结合，从而决定宿主范围及其传染性。可见，这些位点的变化可能与其宿主范围、抗原性和致病性有关，值得进一步深入研究。
3.4.发病机制
通过检测CPV衣壳蛋白与不同宿主受体和衣壳抗体之间的相互作用，我们发现三者之间的动态相互作用控制细胞感染和宿主范围。研究指出，VP2蛋白和氨基酸残基的变化影响病毒与TfR结合的能力。除了与受体结合外，氨基酸残基的变化会影响病毒衣壳的稳定性，而氨基酸残基的变化会影响衣壳的组装，使病毒无法转运出细胞核，从而失去病毒的活性。活动[8]。 CPV感染可导致细胞早期凋亡，在CPV感染引起的细胞凋亡中起重要作用。研究表明，CPV感染可激活-9，表明线粒体凋亡途径参与其中，包括线粒体去极化和复极化，以及线粒体活性氧（ROS）水平的变化。 -8也能被激活，表明死亡受体途径也参与了细胞凋亡过程。此外，-3在感染过程中也会被激活[9]。研究表明CPV的非结构蛋白NS1是诱导细胞凋亡的重要因素。 NS1可引起Hela细胞凋亡，且该过程不依赖于p53通路。同时，NS1的表达涉及细胞周期在G1期的阻滞以及线粒体的相应变化，如去极化、细胞色素C的释放、-9的激活和ROS水平的积累[4]。
晚期CPV感染可诱导核孔复合物（NPC）和核纤层蛋白B1在心尖处积累，并伴有核纤层蛋白A/C（核纤层蛋白A/C）表达水平下降。新形成的 CPV 衣壳位于顶端 NPC 附近。最终，它导致鼻咽癌顶端富集和核纤层重组，从而促进晚期感染[10]。随着高通量技术的快速发展，相关的高通量测序技术也被应用于CPV发病机制的研究中。猫感染了 CPV，通过测量猫空肠的表达谱，成功富集了对细胞因子和生长因子至关重要的 JAK-STAT 信号通路。这为分析CPV感染和适应的分子机制提供了参考，也为防控提供了依据。该疾病提供了替代的抗病毒策略[11]。 iTRAQ定量蛋白质组学分析了F81细胞在不同时间点对CPV感染的反应，发现29个差异表达蛋白在参与p53调控的网络中富集。该研究揭示了与 CPV 感染相关的关键细胞因子的全身变化。有助于了解CPV抗癌活性的分子机制以及CPV感染引起的细胞病变效应[3]。此外，通过染色质免疫沉淀和高通量测序发现，感染后期的细小病毒复制品富含组蛋白，且两个病毒启动子富含组蛋白H3赖氨酸27乙酰化()。结果表明组蛋白离子的乙酰化对于病毒基因表达和病毒生命周期的完成至关重要[12]。
4. 实验室诊断方法
4.1.聚合酶链式反应
基于聚合酶链式反应（PCR）的诊断方法已有许多研究报告。有研究开发了三重PCR/RT-PCR检测技术，可以快速检测犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）和犬冠状病毒（CaKoV）[13]。通过两组引物和探针，可以同时检测和区分CPV-2及其变种CPV-2a、2b和2c四种抗原类型[14]。此外，一些研究建立了ARMS-PCR（-PCR）方法，该方法是一种两步法，首先区分CPV-2a和CPV-2b/CPV-2c，然后使用特异性引物确定是否是CPV-2c存在。 ARMS-PCR方法不依赖测序，可以同时检测和分型CPV-2变异体[15]。为了满足CPV现场快速检测的要求，一些研究建立了保温等温PCR（PCR，iiPCR）检测方法。借助仪器，反应混合物可以自动依次通过毛细管中的不同温区，设备在10秒内完成PCR所需的三个阶段（变性、退火和延伸）。反应过程中探针水解产生的光信号由数据处理模块转换为反应后/反应前比率，并在显示屏上自动报告为阳性。 /阴性结果。该方法整个过程大约需要1小时，灵敏度为实时荧光定量PCR的98.41%，特异性和一致性良好，可以满足临床检测的需要[16]。
4.2.高分辨率熔解曲线技术
针对VP2编码蛋白基因设计两套引物，结合巢式PCR技术建立高分辨率熔解曲线技术（high-HRM）PCR方法（PCR-HRM）。该方法能够根据熔解温度和熔解曲线形状的差异区分CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c之间的单核苷酸多态性。该方法为 CPV 抗原分型提供了更好的替代方案 [17]。
4.3.环介导等温扩增技术
将免疫捕获和环介导等温扩增（LAMP）技术相结合，建立了免疫捕获LAMP方法（-LAMP、IC-LAMP）。该方法采用兔抗VP2蛋白多抗进行病毒捕获，制备微管，捕获的病毒用于后续LAMP，扩增产物可采用琼脂糖电泳或酶联免疫吸附试验（IC-LAMP-assay，IC -LAMP-ELISA）和层析试纸技术（IC-LAMP-flow、IC-LAMP-LFD）进行分析，其中IC-LAMP-ELISA和IC-LAMP-LFD可在1.5 h内获得检测结果[18] 。
4.4.重组聚合酶扩增方法
重组聚合酶扩增（RPA）是一种新型等温基因扩增技术，被广泛认为可以取代PCR方法。针对CPV VP2基因设计引物，优化后38℃恒温反应15分钟即可得到结果。成功建立了基于RPA的检测方法，其灵敏度是普通PCR方法的10倍[19]。此外，结合侧流层析试纸条建立了利用RPA技术的无设备视觉LFS RPA（flow strip RPA）检测方法，可检测CPV-2a、2b和2c。 RPA反应完成后，5分钟内即可在试纸上看到测试结果。其灵敏度也与实时荧光定量PCR结果相当[20]。
4.5、xTAG方法
针对CDV、CPV、犬副流感病毒(CPIV)、CAV和狂犬病病毒(RV)基因的保守区域设计引物，下游引物用生物素标记。然后通过荧光读数器以高通量方式检测扩增产物。仪器采集多重PCR产物与标记荧光微球杂交形成的荧光强度，结合相应软件对检测结果进行分析。研究结果表明，xTAG方法可以同时检测犬体内5种主要病毒，检测结果与常规PCR方法检测结果完全一致[21]。
4.6.免疫层析法
近年来，市场上已有免疫层析（IC）试纸条出售，但由于其使用针对不同表位的单克隆抗体作为捕获和检测抗体，因此价格昂贵。值得一提的是，使用CPV重组截短蛋白生产的兔多克隆抗体作为捕获抗体，而商业单克隆抗体作为检测抗体，成功组装了新的测试条，其灵敏度和特异性与商业测试相同条带基本相同。这种结合单克隆抗体和兔多克隆抗体的方法提供了一种可接受的降低成本的替代方案[22]。
五、防治
5.1.综合防控措施
综合预防主要要注意犬舍的清洁和通风，保持干燥和温暖，同时减少灰尘、有害气体和噪音对犬只造成的应激。户外活动时，避免前往犬只聚集的地方，以免感染。注意科学喂养，避免喂腐烂的饲料，尽量喂易消化的食物，减轻胃肠负担，形成适宜的喂养模式。经常对狗舍、器具、水槽、饲料槽等进行消毒，以防止病原体通过此类介质传播。引进外来犬时，应避免引进病犬，并在引进初期进行隔离。一旦出现犬细小病毒暴发，应果断隔离，早诊断、早治疗。如果没有治疗价值，应尽快扑杀并进行无害化处理。
5.2.特异性免疫
5.2.1.传统灭活疫苗和弱毒疫苗
目前，国内针对CPV的疫苗主要有江西生物制药厂和吉林省五星级动保制药厂生产的犬瘟热、犬副流感、犬腺病毒和犬细小病毒四联活疫苗。国外主要有硕腾公司生产的犬细小病毒活疫苗、四联疫苗和七联疫苗，英特威国际有限公司（BV）生产的犬瘟热和细小病毒二联活疫苗和四联疫苗。联合活疫苗，以及西班牙HIPRA生物制药公司（HIPRA，SA）和梅里亚有限公司（INC）生产的六联疫苗。
5.2.2.基因工程疫苗相关研究
除了传统的灭活、减毒疫苗外，研究人员还结合分子生物学技术，对新型基因工程疫苗进行了相关探索。研究人员使用多种表达系统表达犬细小病毒VP2蛋白并组装获得病毒样颗粒。他们使用大肠杆菌表达系统来表达 VP2 蛋白。该蛋白还可以自组装成病毒样颗粒（VLP），并且抗原表位正确存在于VLP上。相关研究表明VLP疫苗在CPV预防中的潜在作用[23]。通过将狂犬病病毒糖蛋白和 CPV VP2 基因亚克隆到双顺反子载体中，开发了针对犬狂犬病和细小病毒感染的双顺反子 DNA 疫苗。研究表明，双顺反子 DNA 疫苗可用于诱导针对狂犬病和 CPV 的病毒中和免疫反应 [24]。 CPV VP2蛋白的部分表位与霍乱毒素B亚基融合并在转基因烟草叶绿体中表达。当给小鼠喂食压碎的转基因植物组织的悬浮液时，可以在血清中检测到特异性 IgA 抗体。联合免疫（单次注射后口服加强免疫）可检测血清中的 IgG 和 IgA 抗体。尽管诱导体液反应，但口服产生的抗体在体外试验中没有显示出中和能力[25]。使用经过减毒传代并携带两种狂犬病病毒（RABV）糖蛋白的重组狂犬病病毒作为载体来表达CPV VP2蛋白。两者都能够在小鼠体内成功表达 VP2 蛋白并产生高水平的狂犬病抗体和抗 CPV 抗体。 VP2 抗体。同时，重组RABV免疫的小鼠80%以上能够在RABV标准CVS-24毒株的攻毒感染测试中存活下来。结果表明，表达VP2的重组RABV可诱导针对RABV和CPV的保护性免疫反应，可作为潜在的联合疫苗[26]。相关VLP疫苗、核酸疫苗、转基因植物疫苗和病毒载体疫苗仍需进一步评估。
5.3.其他潜在的制剂和成分
除了免疫相关制剂外，某些制剂和成分也用于评估或辅助治疗。如马脂多糖抗毒素、重组杀菌/增透蛋白、干扰素-ω、奥司他韦、人重组粒细胞集落刺激因子[27]、可溶性犬转铁蛋白受体、氯化锂、磷酸化板蓝根多糖、N-乙酰半胱氨酸等。值得一提的是，66只感染CPV的幼犬在2家宠物医院接受了标准治疗和粪便菌群移植的评估。粪便菌群移植组于入院后6 h～12 h直肠给予10 mL生理盐水稀释液。 10 克健康狗的粪便。存活犬中，与标准治疗组相比，粪便菌群移植组腹泻症状消退更快，住院时间更短，差异显着。同时，标准组的死亡率为36.4%（12/33），而粪便菌群移植组的死亡率为21.2%（7/33），但没有统计学差异，表明粪便菌群移植组的死亡率为21.2%（7/33）。微生物移植治疗可以导致更快的消退。腹泻症状[28]。
六、总结
近年来，CPV基因组序列发生了多次变化，产生了许多突变株。大量病毒株给临床鉴定和分型带来更大挑战，同时疾病防控压力也越来越大。开发灵敏、特异和易于使用的诊断方法或检测技术仍然是未来的重要研究方向之一。此外，有必要评估现有疫苗对突变株的保护能力。在此基础上，有必要明确开发针对新抗原原型的疫苗的必要性，并探索新型基因工程疫苗预防该疾病的可能性。在机制研究方面，仍需进一步评估突变株的致病性和跨宿主传播的风险。研究病毒对宿主的影响和分子机制，寻找潜在的治疗靶点，评估针对治疗靶点的药物用于临床治疗的可行性。
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