生物催化剂的来源与筛选.ppt 22页
第三章生物催化剂的来源与筛选概述 3.1 概述 3.2 微生物酶的筛选策略 3.3 微生物和酶的一般筛选方法 3.4 优良细菌的选育 3.5 从环境中筛选微生物基因组 DNA 酶法 3.1 概述 3.1.1 微生物酶法的概念生物催化剂 1 生物催化剂：是催化生物反应的游离或固定化酶的总称。 2 分类 3.1.2 生物催化剂的来源和多样性 3.1.3 寻找和发现生物催化剂的基本原则，提高筛选效率 ① 需要设计合适的酶促方法，使目标反应非常明确 ② 需要设计有前景的酶3.2 微生物酶筛选策略 3.2.1 常规生物催化剂筛选的一般策略 生物催化剂筛选的反应过程 生物催化剂筛选的设计实例生物催化剂筛选的反应过程： ① 生物法：腈水合酶和酰胺酶催化反应产生丙烯酰胺酶或产酶微生物的筛选 产酶微生物筛选的一般原则 ① 能在较短时间内发酵 ② 微生物应使用廉价、优质的尽可能方便地生产酶的原料； ③微生物产生的酶应具有较高的专一性； ④使用的微生物应是非致病性的，不产生有害物质。 性安全的微生物 ⑤微生物的遗传稳定性应较高。 筛选生物催化剂的主要方法有（1）从商业酶库中筛选（2）从已知菌株来源和菌株保藏中心筛选生物催化剂（3）从自然界中筛选生物催化剂发现和筛选产酶微生物（4）从基因库中筛选3.2 .2 从极端微生物中筛选极端酶的策略 极端酶（ ）是由极端微生物（ ）产生的酶，相应的中间类型是正常微生物产生的酶（ ）。
如何进行极端酶的研发 ①要有足够的酶，这就涉及到极端微生物的培养 ②依靠中间宿主表达极端酶 表3-1 一些具有应用前景的超耐热酶 3.2． 3 未培养生物催化剂的发现策略 未培养微生物（ ） 美国微生物学家实验室于1982年首次提出“不可培养微生物（ ）”的概念。他们发现将快速生长的霍乱弧菌和大肠杆菌移植到未培养微生物中。 盐水中长期低温保存后，细胞数量没有减少，代谢活性也没有变化，但在正常肉汤培养条件下没有产生菌落，所以他们用的是“活的但不可培养的（但是，VBNC）”用一个词来描述细菌的这种潜在状态。 3.3 微生物和酶的一般筛选方法 3.3.1 从自然界发现的产酶微生物的取样和富集培养：根据微生物的生理特性，当目标微生物含量较少时，设计选择性培养基，以创造有利的生长条件是指目标微生物能够在最适宜的环境中快速生长繁殖，数量增加，由自然条件下的劣势种转变为人工环境下的优势种。 它分为两种不同的方法：分批式（摇瓶培养）和恒化器式（连续培养）。
分离与筛选 图3-2 从自然界中发现产酶微生物的方法 3.3.2 生物催化剂的高效筛选 高通量筛选（high-，HTS）是近年来发展起来的一种新型筛选技术。 其特点是微量、快速、灵敏、准确，可在短时间内检测大量微生物。 3.4 优良育种菌株和优良生产菌株的基本特征应为： ① 生产菌株应能在较短的发酵周期内产生大量的发酵产物； ② 发酵过程中不产生或很少产生，且性质与反应产物或副产物的目标产物便于分离纯化。 ③可利用多种来源的原料，对发酵原料成分波动不太敏感。 可采用廉价易得的原料进行培养，降低发酵成本。 ④ 对需要添加的前体物质（底物）具有耐受性，不使用底物和产物作为一般碳源。 ⑤具有抵抗细菌污染和噬菌体感染的能力。 ⑥发酵泡沫少，有利于提高装料系数，提高单罐产量，降低发酵成本。 ⑦生长繁殖能力强，生长速度快，遗传特性稳定。 3.4.1 自然育种 ( )：不经人工处理，利用微生物自然突变进行菌株育种的过程。复壮 3.4.2 诱变育种原理 诱变育种 表 3-2 利用各种常用诱变剂进行诱变育种的基本方法 3.5 方法用于筛选环境中微生物基因组DNA中的酶 来自土壤和水样 土壤样品中提取DNA→分离去除细菌→分离收集DNA片段→限制性内切酶切割DNA→PCR扩增→克隆至BAC载体→转化和培养微生物（大肠杆菌）→筛选转化子→功能基因→新酶土壤构建微生物DNA文库**结构形式细胞酶多细胞生物游离催化剂固定化催化剂设计反应流程选择合适的酶或产酶微生物建立有效、便捷的分析方法图 3-1 乙内酰脲酶与 N-氨基酸 甲酰氨基酸水解酶两步选择性水解制备 Dp-羟苯基甘氨酸 CH2=CH-COOH CH2=CH-CN 腈水合酶 H2O CH2=CH-CONH2 H2O 酰胺酶 ②传统方法：铜催化丙烯腈水合生产丙烯酰胺以除去O2。 丙烯腈水浓缩除去Cu离子并脱色。 丙烯酰胺产品催化剂的回收。 催化剂的制备。 未反应丙烯腈的分离80。乳糖水解β-半乳糖苷酶未测定。 木二糖水解β-木糖苷酶。 酶 105 纤维二糖水解酶 100~105 半乳甘露聚糖水解酶 92 甘露聚糖水解酶 95 纤维素水解酶 A、β-葡聚糖酶 B 105 纤维素水解酶 85~90 淀粉水解酶 105 水解 xy木中的兰制浆造纸生产 木聚糖酶 95 葡萄糖 → 果糖，生产高果糖浆 葡萄糖 组成酶活性的最佳温度/°C 功能酶的多因素低剂量诱变作用 互变异构效应 突变 基因突变 染色体畸变 噬菌体、转座子