一种EB病毒感染棉耳绒猴模型的构建方法
一种EB病毒感染棉耳狨猴模型的构建方法
技术领域
1.本发明属于动物模型构建领域，具体涉及一种EB病毒感染的棉耳狨猴模型的构建方法。
背景技术：
2. -Barr病毒（-barr病毒）是一种γ-孢子病毒，是一种普遍存在的人类病毒，可以感染世界上90%以上的人口。它具有潜在感染正常上皮细胞、B 淋巴细胞和 NK/T 细胞的特性。当人体免疫系统失衡时，可发展为多种疾病甚至恶性肿瘤，如传染性单核细胞增多症（IM）、免疫缺陷个体B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤（bl）、霍奇金病（hg）、nk/ T细胞淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌等。
3、由于它具有潜在的致癌性，因此开发预防性疫苗来阻断其感染就显得尤为重要。 EB病毒具有宿主偏好，其在自然界中的正常宿主是人类。尽管已经建立了人源化小鼠的EB病毒感染动物模型，但人源化小鼠不能产生体液免疫。体液免疫，特别是中和抗体的产生，对于预防 -Barr 病毒至关重要。因此，构建可感染EB病毒且具有正常免疫系统的动物模型对其疫苗研发显得尤为重要。
技术实现要素：
4、本发明的目的是提供一种EB病毒感染棉耳狨猴模型的构建方法。
5、本发明采用的技术方案是：
6、本发明第一方面提供了一种EB病毒感染的棉耳狨猴模型的构建方法，包括：将EB病毒感染棉耳狨猴； EB病毒感染剂量为1-2
×
10
10
/公斤。
7.在本发明一些实施例中，EB病毒感染剂量为500μ/kg； GRU和病毒拷贝数的换算方法是：从相应GRU量的EB病毒中提取DNA，利用定量PCR计算出这些GRU中-Barr病毒DNA的拷贝数。
8.在本发明的一些实施例中，EB病毒感染的方式为接触传播、口服给药、静脉注射、皮下注射、腹腔注射或粘膜给药。
9、在本发明一些实施例中，EB病毒感染的方式为静脉注射和/或腹腔注射；静脉注射进一步为大腿静脉注射。
10.在本发明的一些实施例中，在感染前进行麻醉，麻醉时使用的麻醉剂为舒达、氯胺酮和戊巴比妥中的至少一种。首选舒达，因为舒达可以达到最好的麻醉效果，即5分钟内即可入睡，麻醉持续长达1小时。本发明不限制Serta的具体规格。常用的规格有舒达20、舒达50、舒达100等规格。
11、在本发明一些优选的实施例中，麻醉剂的剂量为12至16mg/kg，例如12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg或16mg/kg。 。
12、在本发明一些优选的实施例中，所述麻醉剂的剂量为14mg/kg。
13、在本发明的一些实施例中，舒达的主要成分为替来他明和佐拉酰米；其中
替来他敏6-8mg/kg，唑拉齐米6-8mg/kg。
14、在本发明一些实施例中，麻醉剂的注射方式为肌内注射、皮下注射或静脉注射；最好是肌肉注射。
15、在本发明的一些实施例中，该方法还包括评估模型；评估内容包括：体重、体温、身体状况、EB病毒抗体滴度、EB病毒拷贝数、棉耳狨猴淋巴结状况或埃伯鉴定。
16.在本发明的一些实施例中，棉耳狨猴的淋巴结状况为棉耳狨猴的腋窝淋巴结状况和腹股沟淋巴结状况。
17、在本发明的一些实施例中，EB病毒拷贝数检测是选择EB病毒的balf5基因作为检测其拷贝数的基因。
18.在本发明的一些实施例中，balf5基因通过PCR检测。
19、 在本发明的一些实施例中， PCR中扩增balf5基因的引物序列为：
20.balf5-1f：5
'-
-3'；
21.balf5-1r：5
'-
-3'。
22.在本发明的一些实施例中，棉耳狨猴的腋窝和腹股沟淋巴结状态的检测通过pet、mr、ct、pet-mr、pet-ct和超声检测中的一种或多种进行。 。检测。
23、在本发明一些优选的实施例中，棉耳狨猴腋窝和腹股沟淋巴结状态的检测通过PET、PET-MR或PET-CT进行。
24、在本发明的一些实施例中，进行检测时，所用的显像剂为f18-fdg、f18-flt、氨基酸、胆碱、受体显像剂、核苷酸或11c乙酸盐；优选的是f18-fdg。
25.在本发明的一些实施方案中，显像剂的剂量为1至3m ci/kg，例如1.1m ci/kg、1.2m ci/kg、1.3m ci/kg、1.4m ci/kg , 1.5m ci/kg, 1.6m ci/kg, 1.7m ci/kg, 1.8m ci/kg, 1.9m ci/kg, 2.0m ci/kg, 2.1m ci/kg, 2.1m ci/kg, 2.2 m ci/kg、2.3m ci/kg、2.4m ci/kg、2.5m ci/kg、2.6m ci/kg、2.7m ci/kg、2.8m ci/kg、2.9m ci/kg 或 3.0m ci / 公斤。
26.在本发明的一些实施方案中，显像剂的剂量是2m ci/kg。
27、本发明中，尚无棉耳狨猴年龄和性别对EBV感染的相关研究，对棉耳狨猴的年龄和性别没有具体限制。
28、本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的构建方法制备的EB病毒感染棉耳狨猴模型的用途：
29. (i) 用于筛选或评价能够预防、缓解或治疗EB病毒感染的药物；或者
30. (ii) 用于筛选或评价可预防EB病毒感染的疫苗；或者
31. (iii) 研究EB的感染过程或发病机制。
32、本发明第三方面提供了一种检测棉耳狨猴身体病变的方法：通过PET和/或MR检测棉耳狨猴，其中PET的检测参数如下表所示：
33. 采集时间矩阵fov视场层厚度重建算法其他30分钟192*。
34.MR检测参数如下表所示：
[0035][0036]
PET-MR检查大大减少了辐射损伤。与其他方法相比，其灵敏度高、准确度好。但在该专利之前，PET-MR主要用于人体疾病检测，而PET-MR技术并未用于猴子尤其是棉耳狨猴的相关研究；然而，人类和猴子的身体条件有较大差异，因此适合人类检测的pet-mr参数并不擅长检测棉耳狨猴。发明人花费大量精力开发出适合棉耳狨猴的PET-MR检测参数，不仅可以检测棉耳狨猴腋窝淋巴结和腹股沟淋巴结的状况，还可以准确检测其他高吸收和身体患病部位。 ，也可用于其他猴子的检测，填补了这方面的空白。
[0037]
本发明的有益效果是：
[0038]
本发明首次构建了棉耳狨猴EB病毒感染模型。通过优化病毒剂量、麻醉方法等条件，可以使棉耳狨猴长期携带EB病毒，最长可达8周。另外，在优化的EB病毒剂量范围内，也是安全的。感染后模型可长期存活且体重不减轻，整体状况良好；为EB病毒预防性疫苗提供灵长类动物模型；可用于EB疫苗的保护作用，尤其是长期保护。效果评价。
[0039]
本发明还建立了系统的分子、影像和病理检测系统，能够全面、动态地检测并提供不同滴度感染EBV的棉耳狨猴的综合信息。特别是建立了检测棉耳狨猴的PET-MR检查方法，可以更准确地检测棉耳狨猴的身体病理情况。
[0040]
本发明模型构建时间短、操作简单、易于观察、节省成本、稳定性好、重复性强、建模成功率高。
附图说明
[0041]
图1为体温检测图。
[0042]
图2为重量检测图。
[0043]
图3为注射EBV后不同时间点棉耳狨猴血液中EBV拷贝数的检测。
[0044]
图4为EB病毒感染后不同时间点血液中EB病毒特异性抗体的检测情况。图4a显示了检测EB病毒糖蛋白gb的igm效价；图4b显示了检测EB病毒糖蛋白ghgl的igm效价；图4c显示了检测EB病毒糖蛋白gp350的igm效价。
[0045]
图5为检测EBV感染后不同时间点淋巴结大小变化的成像效果。
[0046]
图6是EBV感染后不同时间点检测到的淋巴结大小变化的统计图。
[0047]
图7为EB病毒感染后不同时间点检测淋巴结代谢的成像效果。
[0048]
图8为EBV感染后不同时间点检测到的淋巴结代谢统计图。
[0049]
图9为EBV感染后不同时间点检测到的整体代谢展示图。
[0050]
图10显示-Barr病毒感染后腋窝淋巴结细胞液中Eber的检测。图10a为阳性对照；图10b为高剂量EB病毒组；图10c是PBS对照组。
[0051]
图11显示了-Barr病毒感染后腋窝淋巴结组织中Eber的检测。图11a显示PBS对照组；图 11b 显示注释
高剂量EB病毒注射组；图11c显示低剂量EB病毒注射组。
具体实施
[0052]
下面结合实施例，对本发明的构思及所达到的技术效果进行清楚、完整地描述，以便充分理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0053]
-Barr病毒：又称人类疱疹病毒4型，属于伽马疱疹病毒亚科，是一种人类致癌病毒。
[0054]
rmi-1640培养基：主要用于培养肿瘤细胞系的细胞培养基。
[0055]
fbs：又称胎牛血清，用于为培养细胞提供营养因子。
[0056]
cne2-ebv-gfp细胞：携带ebv基因组的鼻咽癌上皮细胞系，用于诱导产生具有绿色荧光的EBV。
[0057]
tpa：(2s)-(1-外氢嘧啶-2-酮)-3-甲基丁酸。
[0058]
丁酸钠：英文名。
[0059]
g418：遗传霉素是一种氨基糖苷类抗生素。
[0060]
akata-cell：一种不携带 -Barr 病毒基因组的人淋巴母细胞。
[0061]
hne1-细胞：人鼻咽癌上皮细胞系。
[0062]
gru（绿色raji单位）：EB病毒滴度单位，计算公式如下gru = raji细胞总数
×
gfp raji%/eb 病毒量。
[0063]
td50：B 细胞转化单位（剂量）。
[0064]
PET：正电子发射计算机断层扫描（ ，简称PET），是核医学领域较为先进的临床检查成像技术。
[0065]
先生： 磁共振检查（ ）是一种医学检查方法。
[0066]
超声检查：一种基于超声（超声波）的医学成像诊断技术，可以使肌肉和内脏器官可视化，包括其大小、结构和病理病变。
[0067]
舒泰50：又称盐酸蒂塔拉敏、盐酸唑拉西泮，用于麻醉动物狨猴。
[0068]
盐酸氯胺酮：全名2-邻氯苯基-2-甲氨基环己酮。
[0069]
PCR：PCR一般指聚合酶链式反应。它是一种用于扩增特定 DNA 片段的分子生物学技术。
[0070]
qPCR：实时PCR（实时PCR，qPCR）是一种使用荧光化学物质来测量DNA扩增反应中每个聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或外参方法对待测样品中特定DNA序列进行定量分析的方法。
[0071]
Eber检测：Eber是-Barr病毒编码的小RNA，在-Barr病毒感染的细胞核中高拷贝存在。
[0072]
pet-mr：结合正电子发射计算机断层扫描pet和磁共振成像mr.的大型功能性代谢和分子影像诊断设备。同时具备pet和mr的检查功能，可进行全身解剖水平+代谢水平检查，缩短检查时间，辐射低，无电离辐射。
[0073]
f18-fdg：也称为2-氟-2-脱氧-d-葡萄糖，pet显色剂。
[0074]
仪器为联影upmr 790。
[0075]
实验材料：fbs购自本公司，rpmi 1640购自本公司，eber检测试剂盒购自中山金桥，qPCR试剂购自中山金桥，舒泰50购自维科贸易有限公司，氯胺酮购自盐酸盐购自中牟北康公司。
[0076]
示例1 pet mr参数
[0077]
pet mr主要用于人体图像检测；其人体检测参数如表1、表2所示：
[0078]
表1 人类宠物参数
[0079]
采集时间矩阵fov视场层厚度重建算法其他30分钟150*。
[0080]
表2 人体mr参数
[0081][0082]
但用于人类的参数并不适合猴子，尤其是棉耳狨猴，现有技术中还没有针对棉耳狨猴的PET-MR检测的相关研究。申请人利用人体参数对棉耳狨猴进行检测，结果显示利用人体参数扫描的狨猴图像不清晰，无法清晰呈现。
[0083]
申请人根据棉耳狨猴的特性进一步对参数进行优化调整，主要是通过te回波时间、te重复时间、矩阵等参数来保证最优的参数组合，因为只要有一个参数时钟不合适，这会导致失败。为了达到最佳的成像效果，我们最终获得了可用于棉耳狨猴和其他猴子的PET-MR检测参数，可以准确评估棉耳狨猴的疾病状态。详细信息请参见表 3 和表 4。 :
[0084]
表3 棉耳狨猴宠物参数
[0085]
采集时间矩阵fov视场层厚度重建算法其他30分钟192*。
[0086]
表4 棉耳狨猴mr参数
[0087][0088]
实施例2 eb病毒的产生和定量
[0089]
1) 在 5% CO2 细胞培养箱中于 37°C 下在维持培养基（RPMI-1640 培养基 + 10% fbs + 1% 链霉素/青霉素 + g418）中培养 cne2-ebv+ 细胞。
[0090]
2) 当cne2-ebv+细胞密度达到100%时，加入丁酸钠和tpa。共培养12小时后，除去含有丁酸钠和tpa的培养基，加入不含g418的维持培养基。
[0091]
3) 培养3天后，收集上清，25℃孵育10分钟。通过 0.8 μm 细胞过滤器过滤上清液。将滤液转移至超速离心管中并在 4°C 下孵育 3 小时。
[0092]
4) 弃去上清液，将病毒颗粒溶解在rpmi-1640培养基中，分装并冷冻在-80°C。
[0093]
5) 将-80℃冷冻的EB病毒放入冰中解冻。
[0094]
6) 取细胞活性良好的akata-细胞，按每孔10,000个转入96孔板，每孔体积100 μl（培养基组成为rpmi-1640+10% fbs+1%链霉素/青霉素） ）。
[0095]
7) 分别向96孔板中加入20μl、10μl、5μl、2.5μl和1.25μl浓缩病毒，每个病毒量重复3次。
[0096]
8) 将体积加至200 μl，培养2天。
[0097]
9)流式细胞仪检测akata细胞中gfp阳性细胞的比例，并根据公式计算EB病毒gru滴度。计算公式如下：gru = raji细胞总数
×
gfp raji%/eb 病毒量。
[0098]
实施例3 棉耳狨猴的EB病毒感染
[0099]
1)取2-3岁健康雌性棉耳狨猴3只，隔离饲养，每笼一只。
[0100]
2)取Serta 50溶于PBS，计算剂量14mg/kg，肌注给棉耳狨猴，等待麻醉后进行后续处理，从-80℃取出先前冷冻的EB病毒，将其放入冰块中解冻。 。
[0101]
3）用1ml注射器吸取0.5ml血液，转移至肝素钠采血管中，取50μl全血-80冷冻。其余的-80℃4℃冷冻10分钟，将血细胞分离成pbmc。
[0102]
4)采血后，取棉耳狨猴1只(300g)，设为高剂量组(高剂量ebv)。高剂量狨猴为300克。感染剂量为：EBV 200万格鲁，EB病毒DNA拷贝数为4.2。
×
109；用1ml注射器吸取cne2-ebv-gfp细胞产生的200万GRU单位的EB病毒1ml，同时注射0.5ml至大腿静脉，0.5ml注射至腹腔内。取棉耳狨猴1只（250g），设为低剂量组（低剂量ebv）。低剂量狨猴为250克。感染剂量为：ebv 20,000 gru，EBV DNA拷贝数为4.2。
×
107：用1ml注射器吸取cne2-ebv-gfp细胞产生的单位的EB病毒1ml，大腿静脉注射0.5ml，腹腔注射0.5ml。取1只棉耳狨猴（300g）作为对照组（无ebv）：用1ml注射器吸取1m PBS，大腿静脉注射0.5ml，腹腔注射0.5ml。
[0103]
5）棉耳狨猴感染EB病毒前后，应每天测量其体温和体重。同时每周要做一次pet-mr，采集血液和唾液。
[0104]
体温检测结果如图1所示；结果表明，注射EB病毒（200万GRU单位）不会引起棉耳狨猴体温的剧烈波动。重量检测图如图2所示；结果显示，除了第0周到第一周因为狨猴移居新环境导致体重减轻外，第二周体重开始上升。同时，注射大剂量EB病毒后，不会影响狨猴的体温和体重。综合体温和体重显示，200万格EB病毒不会影响棉耳狨猴的体温和体重，该猴身体状况良好。
[0105]
麻醉方面，申请人采用盐酸氯胺酮25mg/kg进行静脉麻醉。结果发现，猴子需要20分钟才能入睡，而且麻醉程度低，容易翻身，会影响PET-MR扫描。申请人还尝试了氯胺酮和戊巴比妥麻醉剂，但均无法达到深度麻醉。因此，选择Serta 50进行麻醉可以达到最佳的麻醉效果，即5分钟内入睡，麻醉持续长达1小时。
[0106]
实施例4 EB病毒感染棉耳狨猴后血液中EB病毒拷贝数的检测
[0107]
1)EB病毒注射前后，棉耳狨猴每周用Serta麻醉，用1ml注射器从大腿静脉抽取0.5ml血液，转移至肝素钠抗凝管中。
[0108]
2) 取50μl全血提取DNA。具体步骤如下：
[0109]
a) 选择Omega公司的ezna DNA试剂盒，按照说明书配置各试剂。
[0110]
b) 将全血转移至1.5ml无菌管中，加入试剂盒中提供的200μl。
[0111]
c) 添加 25 µl ob。
[0112]
d) 添加 250μl bl。涡流。
[0113]
e) 放入 70°C 金属加热器中加热 10 分钟。
[0114]
f) 加入250 μl无水乙醇，混匀，转移至2 ml DNA收集管中。
[0115]
g) 离心，25°C，1 分钟。
[0116]
h) 添加 500μl HBC 30 秒。
[0117]
i) 加入700μl洗脱液1分钟，弃去废液。
[0118]
j) 重复上述一次。
[0119]
k) 排空管道，2 分钟。
[0120]
l) 在室温下放置 2 分钟。
[0121]
m) 将收集柱放入新的灭菌管中，加入预先加热至70℃的灭菌水，静置2分钟。
[0122]
3) 选择-Barr病毒的balf5基因作为检测其拷贝数的基因。引物序列如下：
[0123]
balf5-1f：5
'-
(序列号1)-3'；
[0124]
balf5-1r：5
'-
(序列号2)-3'。
[0125]
配置系统如表5所示。
[0126]
表5 qPCR反应体系
[0127]
成分 体积 sybr 染料 (2x) 10μ-1f 5' (10μm) 0.3μ-1r 5' (10μm) 0.3μl 无菌超纯水 补足至 20μl
[0128]
qPCR反应程序如表6所示。
[0129]
表6 qPCR反应程序
[0130][0131]
4）根据网站计算血液中的DNA。
[0132]
结果如图3所示。第0周采血后，将受试者麻醉并注射-Barr病毒，同时进行上述体温和体重实验。从血液中提取DNA，并通过qPCR检测EB病毒拷贝数。结果显示，注射EB病毒前，血液中检测不到EB病毒基因组。注射EB病毒后，高剂量组血液中的EB病毒先升高后降低，但注射后A可检测水平仍维持在第8周。同时，低剂量组降至较低水平第五周之后，即基线。这一结果表明，只需注射200万格的大剂量EB病毒，就能使棉耳狨猴长期携带EB病毒。
[0133]
实施例5 EB病毒感染后血清中EB病毒膜蛋白glgh、gb和gp350特异性igm抗体的检测
效价
[0134]
1) 用 elisa 包被液（30mm 碳酸氢钠，10mm 碳酸钠，pH 9.6）将抗原蛋白稀释至 100ng/100μl 浓度。
[0135]
2) 取ELISA板，加入抗原蛋白，每孔100ng，置于37℃培养箱中2小时。
[0136]
3) 用PBST洗板两次。
[0137]
4) 将溶于 PBS 的 3% 牛血清白蛋白加入 ELISA 板中，每孔 200 μl。
[0138]
5) 将酶标板转移至 4°C 冰箱中并放置过夜。
[0139]
6) 第二天早上取出板，用PBST清洗3次。
[0140]
7) 用PBS将血清稀释100倍至12800倍。
[0141]
8) 置于37℃培养箱中，静置2小时，用PBST洗涤5次。
[0142]
9)用3％BSA将HRP偶联的抗人IGM抗体稀释5000倍，并在室温下放置1小时。
[0143]
10) PBST洗涤5次，加入ELISA反应液。
[0144]
11) 15分钟后用终止液终止反应。
[0145]
12)用酶联免疫检测仪检测od450并计算效价。
[0146]
结果如图4所示。取EB病毒注射前后不同时间点的血清进行ELISA检测EB病毒糖蛋白gp350、ghgl和gb的igm滴度。结果显示，gb的特异性igm抗体效价最高，ghgl的特异性igm抗体效价次之，gp350的特异性igm抗体效价最低。
[0147]
实施例6 -Barr病毒感染棉耳狨猴pet-mr观察腋窝、腹股沟等淋巴结变化
[0148]
1)狨猴感染高剂量EBV，狨猴感染低剂量EBV，PBS对照组。
[0149]
2)实验棉耳狨猴禁水禁食12小时。
[0150]
3）称量体重，服用Serta 50，肌肉注射14 mg/kg。
[0151]
4）棉耳狨猴麻醉后，以2m ci/kg吸收一定量的fdg-18f，用胰岛素针注射到腿末端静脉中，测量注射前后的辐射剂量。
[0152]
5) 将棉耳狨猴放入PET-MR仪器中。此时用医用纱布包裹猴子，防止实验过程中猴子体温过低和活动，从而影响最终图像的质量。
[0153]
6) PET-MR检查完成后，用温热的布盖住棉耳狨猴，放入笼中。当其意识清醒时，用无针注射器注射葡萄糖以恢复能量。
[0154]
EBV感染后不同时间点检测到的淋巴结大小变化如图5和图6所示。
[0155]
本实施例中使用的pet-mr参数如表7和表8所示。
[0156]
表7 宠物参数
[0157]
采集时间矩阵fov视场层厚度重建算法其他30分钟192*。
[0158]
表8 mr参数
[0159][0160]
PET-MR结果显示，注射大剂量EB病毒后，棉耳狨猴腋窝淋巴结体积明显增大。与低剂量EB病毒组和PBS对照组相比，体积明显更大。图5为成像效果图，图6为淋巴结体积统计图。综合表明，仅200万格鲁高剂量EBV感染即可引起棉耳狨猴淋巴结肿大。
[0161]
EBV感染后不同时间点检测到的淋巴结代谢如图7-9所示。
[0162]
PET-MR结果显示，注射大剂量EB病毒后，棉耳狨猴腋窝淋巴结代谢显着增强。与低剂量EB病毒组和PBS对照组相比，代谢最强。图7为成像效果图，图8为淋巴结代谢统计图。下面这组图片展示了整体的新陈代谢。图9显示黑色腋窝，表明组织代谢旺盛。综合表明，仅200万格鲁高剂量EB病毒感染即可引起棉耳狨猴淋巴结代谢增强。这种新陈代谢的增强可能是由炎症或病变引起的。
[0163]
实施例7 获取棉耳狨猴腋窝淋巴液并鉴定Eber
[0164]
1) 棉耳狨猴称重后，按14 mg/kg的剂量进行麻醉。待其入睡后，将耦合剂涂于腋下，然后用探头检查。当检测到相应淋巴结时，用1ml注射器插入并吸出淋巴液，并将吸出的淋巴液转移至无菌1.5ml离心管中。
[0165]
2) 用薄膜旋转器旋转装有淋巴液的 EP 管。膜成功摇匀后，用纸巾笔画圈，风干20分钟。
[0166]
3)用4%多聚甲醛处理20分钟，用PBS冲洗，并在70%、80%、90%、95%和100%酒精梯度中脱水。
[0167]
4) 风干并用胃蛋白酶在 37°C 消化 30 分钟。
[0168]
5) 弃去胃蛋白酶，70%、80%、90%、95%、100%酒精梯度脱水，风干。
[0169]
6) 加入Eber探针，用硅酮胶密封载玻片，置于37℃湿润盒中，避光，放置过夜。
[0170]
7) 除去硅水泥，用PBST清洗3次，每次2分钟。
[0171]
8)加入HRP标记的抗地高辛抗体，37℃孵育30分钟，PBS洗3次，每次2分钟。
[0172]
9) 轻轻涂抹 15 分钟显色。
[0173]
10)复染、脱水、透明、密封。
[0174]
-Barr病毒感染后腋窝淋巴结细胞液中EBER的检测如图10所示。
[0175]
棉耳狨猴注射 EB 病毒 18 周后，对腋窝淋巴结淋巴液进行了 Eber 检测。图10a是阳性对照（EB病毒阳性细胞）。图10b高剂量EB病毒注射后呈阳性。核原位杂交实验表明了Eber的存在。 ，颜色棕色，图10c 注射PBS的对照组EB病毒阴性，核原位杂交实验未见EB病毒。
[0176]
实施例8 棉耳狨猴腋窝淋巴组织的获取及Eber鉴定
[0177]
1) 棉耳狨猴称重后，按14 mg/kg的剂量进行麻醉。等它睡着后，取出右侧的淋巴结组织。
[0178]
2) 4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。
[0179]
3）切片、烘烤、脱蜡。
[0180]
4）以下程序和步骤与淋巴液Eber鉴定相同。
[0181]
-Barr病毒感染后腋窝淋巴结组织中检测到的Eber如图11所示。
[0182]
注射EBV后20周检测棉耳狨猴腋窝淋巴结，并进行Eber检测。图11a为注射PBS的对照组右腋窝淋巴结组织Eber鉴定为阴性（无棕色），图11b为大剂量EB病毒注射组右腋窝淋巴结组织Eber鉴定为阳性（棕色沉淀），而图11c显示低剂量注射Eber后右腋窝淋巴结EBER鉴定EBV呈阴性。该图表明，注射200万格鲁的高剂量EB病毒会导致棉耳狨猴长期携带EB病毒，而2万格鲁的低剂量EB病毒不会导致棉耳狨猴携带EB病毒。长期携带EB病毒。
[0183]
以上特定的实施方案详细描述了本发明，但本发明不限于上述实施方案。可以在艺术中普通技能的知识范围内进行各种变化，而不会脱离本发明的要旨。此外，本发明的实施例和实施方案中的特征可以彼此相互结合而不会发生冲突。