酒石酸作为重要的化工和食品添加剂原料，有L(+)和D(-)两种对映体。 它是化学品和药物合成中重要的手性合成子和手性选择剂。 传统上，L(+)酒石酸是葡萄酒工业的副产品，其产量受自然资源和季节影响。 微生物来源的顺式环氧琥珀酸水解酶（CESH）可用于制备高对映体纯度的手性酒石酸。 是目前工业化生产手性酒石酸的主要方法之一，并于20世纪90年代实现工业化。 尽管CESH是最早应用的工业酶之一，但其催化机理尚未明确分析，从而阻碍了该类工业酶的合理改造和性能提升。 分析CESH的催化机理对于此类工业酶的合理改造和性能提升具有重要意义。 青岛能源研究所代谢组学研究组对CESH[L]和CESH[D]进行了长期研究，产生L(+)和D(-)两种酒石酸。 近期，他们成功解析了CESH的结构和结构[L]。 催化机理方面，相关工作近期发表在生化杂志《生物化学》上。
虽然催化相同的底物CES（顺式环氧琥珀酸），但CESH[L]和CESH[D]具有完全不同的序列、结构和催化机制，分别产生高对映体纯度的L(+)和CESH[D]。 D(-)酒石酸。 研究团队在分析CESH[D]结构和催化机理的基础上，经过多年努力，成功获得了CESH[L]两种不同状态的晶体结构，包括无底物酶和有底物酶。 与产物形成催化中间体和复合物的酶突变体的高分辨率晶体结构。 结构分析表明，CESH[L]以高度特异的方式与具有镜像对称结构的底物CES结合，通过Asp-His-Glu催化三联体实现两步催化水解，其中激活的关键催化残基水分子是 Glu ，而不是之前的研究推测 Asp 在另一个位置，而是发现并鉴定了负责向环氧乙烷上的氧原子提供质子以协助开环反应的氨基酸残基。 这些结果完整地描绘了CESH[L]的立体催化机制，并完美解释了前期研究中的突变分析结果。 高分辨率结构的分析也为进一步合理改造CESH[L]以提高稳定性和催化性能奠定了基础。
在L(+)酒石酸生产中，常采用全细胞催化剂或固定化方法来提高CESH的稳定性[L]。 目前使用的全细胞催化剂均在细胞内表达CESH[L]，细胞膜的通透性影响酶的催化效率和生产性能。 代谢组学课题组与北京科技大学宣劲松副教授课题组合作，成功开发了CESH[L]在大肠杆菌细胞表面高效展示的技术。 酶活性测定结果显示，大肠杆菌表面展示的CESH[L]酶总量超过了大肠杆菌细胞内过表达所能达到的酶总量。 不存在细胞渗透性问题，可多次重复使用。 可在4摄氏度下长期保存，几乎不丧失活性。 该技术为提高L(+)酒石酸工业生产效率提供了新的解决方案。 相关技术申请发明专利（2.4），并于2024年4月9日获得授权。
图 1. 产生 L(+)-酒石酸的环氧化物水解酶的催化机制和细胞表面展示。
(A) CESH[L]催化中间体的晶体结构。 (B)从结构推导CESH[L]的催化机理。 (C) 在大肠杆菌表面展示CESH[L]的全细胞催化剂的示意图、稳定性和可重复使用性。
相关研究是在代谢组学研究组冯银刚研究员、崔秋研究员以及北京科技大学宣劲松副教授的指导下完成的。 该研究工作得到了科技部、国家自然科学基金委、山东能源研究院和北京科技大学相关项目的资助。 （文/图冯银刚）
相关论文及授权专利：
1. 董盛，宣，冯*，崔秋* (2024) 顺式L(+)-酸的-。 J.Biol。 化学。 300（2）：。
2. 冯银刚、宣劲松、周锐、东升、崔秋； 顺式环氧琥珀酸水解酶细胞表面展示系统及其构建与应用，中国发明专利ZL2.4，2024年4月9日授权公告。