诺奖得主阿诺德团队Nature—通过铁-催化的sp3 C-H功能化的酶法组装碳
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尽管碳氢（CH）键在有机分子中大量存在，但它们通常被认为是非反应性的并且不能进行化学操作。 CH功能化技术的最新进展已经开始改变这种逻辑。 在本文中，作者描述了用于 sp3 CH 键的对映体、区域和化学选择性分子间烷基化的铁介导催化剂。 催化剂源自细胞色素 P450 酶，其中天然半胱氨酸轴向配体已被丝氨酸（细胞色素 P411）取代，并在细菌中产生，通过定向进化调节活性和选择性。 这些蛋白质激活铁来进行这种化学反应，为主导 CH 功能化领域的贵金属催化剂提供了理想的替代品。 阿诺德团队报道的酶可以对多种含有苄基、烯丙基或α-氨基CH键的底物进行功能化，具有高转化率和优异的选择性。 他们使得开发几种天然产品的简洁路线成为可能。 使用天然铁-血红素辅因子与这些酶介导 sp3 CH 烷基化表明不同的血红素蛋白可以作为这种生物转化的潜在催化剂，并将促进新的酶促 CH 功能化反应在化学和合成生物学中的应用的发展。
研究内容亮点
生物系统在有机分子构建过程中形成碳-碳（CC）键的策略非常有限。 尽管许多这些策略依赖于功能基团的操作，但某些酶，包括自由基 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 家族的成员，可以烷基化 sp3 CH 键。 然而，这种转化的已知生物学机制仅限于甲基转移或自由基受体底物与特定分子的结合（图1a）。
图1
在本文中，作者尝试引入一种新的 sp3 CH 键烷基化酶反应策略。 在这个设计中，作者从最广泛使用的生物CH功能化转化：CH氧化中汲取了灵感。 细胞色素 P450 等酶使用血红素辅助因子进行 CH 氧化； 它们的活性依赖于分子氧的活化，生成能够选择性插入底物CH键的高能铁氧中间体。 同样，作者假设血红素蛋白和重氮化合物的组合会产生蛋白质包被的铁卡宾，并且该卡宾可以参与与第二底物的选择性CH插入反应（图1b）。
小分子催化中的 sp3 CH 插入通常依赖于基于铑、铱和其他金属的过渡金属配合物1,2。 通过将铱卟啉引入载脂血红素蛋白突变体中，创建了用于卡宾 CH 插入的人工金属蛋白3。 然而，由于酶的蛋白质框架可以显着提高反应速率，甚至赋予原本无反应的辅因子4,5活性，作者假设定向进化可以重新配置血红素蛋白，以克服铁卡宾CH插入反应的障碍，并获得这种新功能（图1b）。
在最初的研究中，作者测试了 78 种血红素蛋白。 将来自整个大肠杆菌细胞的血红素蛋白与对甲氧基苄基甲基醚 (1a) 和重氮乙酸乙酯 (2) 在室温厌氧条件下结合； 分析所得反应产物3a的CH烷基形成（图2a）。
图2
作者发现，来自两个超家族的血红素蛋白表现出低水平的这种混杂活性，从而提高了产生具有截然不同的蛋白质结构的 CH 烷基酶的可能性。 测试的蛋白质中有来自巨大芽孢杆菌的细胞色素突变体，其中轴向半胱氨酸配体被丝氨酸取代，称为细胞色素。 我们发现其中一种突变体 P-4(A82L)22 与野生型相比有 18 个突变，3a 的总转变数 (TTN) 为 13。 此外，一氧化氮双加氧酶第 32 位（R.NOD(Y32G)）的酪氨酸突变为甘氨酸，催化转变数为 7 的反应。
使用 P411 P-4(A82L) 作为起始模板，在大肠杆菌细胞中进行位点饱和诱变和筛选的连续迭代，以鉴定具有增加的 CH 烷基化反应性和对映选择性的生物体。 催化剂。 用于诱变的氨基酸残基包括在活性位点袋内排列的氨基酸残基、位于蛋白质的环和其他柔性区域上的氨基酸残基、或具有亲核侧链的氨基酸残基。 五轮诱变和筛选产生了突变体 P411-gen6，催化产物 3a 的周转数为 60。与天然单加氧酶活性不同，CH 烷基化过程不需要还原这些酶的 FAD 和 FMN 结构域的等价物。 推测这些结构域可能不是 CH 烷基化反应所必需的，作者对 P411 -gen6 进行了系统截短，以确定保留催化活性的最低限度足够的结构域。 值得注意的是，去除包含全长蛋白质中 37% 氨基酸的 FAD 结构域，产生了具有更高 CH 烷基化活性的酶：P411ΔFAD-gen6 为 3a 的生产提供了高达 100 的总周转数，增长1.7倍。 这表明 FAD 结构域可能对 CH 烷基化活性具有（负）变构效应。 另外八轮诱变和筛选产生了 P411-CHF。
P411-CHF的活性是P-4(A82L)的140倍，具有优异的立体选择性。 作者随后表明，可以通过在较低温度（例如 4°C）下进行反应来提高立体选择性，而 TTN 不会发生实质性变化。 并且酶促CH烷基化反应可以在毫摩尔水平上进行（图2b）。
图2
作者进一步分析了 P411-CHF 与一系列苄基底物与重氮乙酸乙酯偶联的反应（图 3）。 我们的结果表明，P411-CHF 可以控制高反应性中间体，以提供具有高对映选择性的所需 sp3 C–H 烷基化产物。
图3
为了证明这种生物转化的实用性，作者将此方法应用于合成应用（图 4a）。 使用含有 P411-CHF 的大肠杆菌，以 2.4 mmol 规模生产中间体 5a，分离产率为 86%，总周转次数为 2,810，ER 为 94.7:5.3。 随后，一系列反应成功生成了(R)-(+)-酸6。此外，本研究还验证了其他有机反应类型的生成（图4.b、c）。
总结与讨论
这项研究表明，细胞色素P450可以获得从sp3 CH键构建CC键的能力，并且利用定向进化可以大大提高反应的活性和选择性。 大自然提供了大量可能的起点，以进一步扩大该反应的范围并实现其他选择性。 细胞色素P450超家族可以利用其天然氧化化学来获得大量有机分子； 作者预见，P411 衍生酶和其他天然血红素蛋白多样性可用于生成 CH 烷基酶家族，以模拟天然 CH 氧化催化剂的范围和选择性。
参考
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文案：悬浮介质的 DNA 解决方案
文章链接：
//-018-0808-5（或点击阅读原文）