聚磷微生物固定化除磷技术

聚磷微生物固定化除磷技术

磷超标是造成水体富营养化的主要原因之一。 研究发现，当总磷浓度超过0.1 mg·L-1（磷是限制因素，mTN:mTP>15:1）时，藻类就会过度生产； 一般在这种条件下，如果总磷浓度超过0.02mg·L-1，就可能导致水体富营养化。 由于水体富营养化现象日益严重，严重破坏了人类赖以生存的自然环境，威胁着人类的健康。 常规生化处理工艺效率低，不能从根本上解决问题。 近年来，微生物除磷工艺的研究发展迅速，主要有A/O、A2/O、UCT、五级等。为了实现微生物除磷工艺的有效实施，筛选出积磷的微生物。除磷能力强的微生物是首要目标。 另外，考虑到富磷微生物对磷的吸收是一个厌氧释磷和好氧吸磷的过程，因此有必要考察富磷微生物对溶解氧的反应。 同时，微生物积累磷的过程会受到有机物分子大小、pH等的影响，因此，研究特定微生物在不同理化条件下的生长和除磷特性是研究的重要一步微生物除磷机理及其应用工程应用先决条件。

为了获得除磷能力强的微生物种质资源，自富磷细菌分离以来，筛选出了多种具有富磷能力的微生物。 许多研究表明， (.) 属细菌在这方面具有能力。 此外，肠杆菌科()、*()、变形菌门()等也是常见的蓄磷微生物，甚至还有具有反硝化功能的蓄磷微生物。 在此基础上，人们开展了大量关于溶解氧对富磷菌除磷能力影响的研究，但这些研究很少涉及不同富磷菌在不同条件下对好氧吸磷能力的相关影响。无氧时间条件。 此外，如pH、有机物分子大小等理化因素对富磷细菌富磷能力的影响也得到了深入研究。 然而，目前的研究大多局限于单一因素的考察，或者侧重于高浓度废水生物处理系统的研究。 目前，富磷微生物除磷工艺距离工程应用还很遥远。 研究表明，微生物的固定化可以为其活性的保留提供保证。 但固定化聚磷菌修复含磷废水的实验尚未见相关报道。 因此，目前还没有相关报道。 ，继续筛选和开发具有除磷能力的微生物，开展聚磷微生物的固定化、活性保留和污水修复研究，开展综合理化因素对除磷能力的影响研究积累微生物，对工程实践具有重要的指导意义。 。

鉴于此，本研究从排污口污泥中筛选出一株具有除磷能力的富磷细菌，并综合考察了各种理化因素对细菌生长和除磷能力的影响。 同时将微生物固定化并考察其除磷能力。 对含磷废水的净化效果。

2。材料和方法

2.1 材料

2.1.1 示例来源

从福州市闽侯县上街镇高崎村排污口采集淤泥样本，立即用于菌株分离和筛选。

2.1.2 培养基

根据文献配制增菌培养基、筛选培养基、微量元素以及缺磷培养基和富磷培养基。 LB培养基（g·L-1）：蛋白胨10.00，酵母粉5.00，.00，琼脂2.00（加固体碱），pH=7.2。 固定化微生物沉淀实验培养基（g·L-1）：琥珀酸钠0.61、.28、.1、KCl0.014、MgSO4·7H2O0.02、CaCl2·2H2O0.018、pH=7.2。

上述所有培养基使用前均经121℃灭菌（碳源实验中，葡萄糖组和蔗糖组均在115℃灭菌）20分钟，灭菌前添加微量元素。

2.1.3 微生物固定化珠制备材料

*(,PVA)、海藻酸盐(,SA)、硼酸(H3BO3)、无水氯化钙(CaCl2)，除硼酸(分析纯)外，其余均为化学纯。

2.2 方法

2.2.1 蓄磷细菌的分离与鉴定

称取新鲜污泥0.5g，用无菌水洗涤，8000r·min-1离心5分钟。 丢弃上清液。 重复此过程三次。 处理后将样品添加到2.1.2节的增菌培养基中，添加量和其他条件请参考文献。 培养12小时后，取1.5mL菌悬液加入下一个磷梯度的培养基中。 磷浓度梯度为2、5、8、10、15、20mg·L-1（以P计算）。

聚磷酸盐细菌含有典型的PHB颗粒和异色颗粒。 经过密集的释磷和吸磷实验，PHB颗粒可以用脂溶性染料苏丹黑染色，异色颗粒可以用甲苯胺蓝、亚甲基蓝染成紫色。 ，可以与其他非颗粒状物质区分开来。 将富集驯化的菌悬液按10-1~10-7的梯度稀释后铺于平板上。 挑选具有特殊形态的单菌落进行 PHB 颗粒染色和异质性。 对染色体颗粒进行染色，以鉴定含有PHB颗粒和异染颗粒的菌落，并进行重新筛选实验。

挑取纯化的单菌落于缺磷培养基中，150r·min-1、30℃培养12h。 将菌液8000r·min-1离心5分钟，然后将菌液转移至富磷培养基中。 ，150r·min-1，30℃，培养至菌液混浊。 计算各菌株的除磷率。 之后，对重新筛选得到的积磷细菌按照文献中的方法进行测序和系统发育分析。

2.2.2 理化因素对富磷菌生长及除磷特性的影响

蓄磷细菌除磷的能力主要是依靠异色颗粒对磷的储存。 细菌在生长过程中还可以利用部分磷来合成细胞成分。 文献报道表明，积磷细菌在厌氧和缺磷条件下可以储存磷。 异色粒子中的磷被释放。 厌氧释磷后，放入富磷培养基中进行除磷实验，可大大提高除磷实验效果。 此外，碳源、氮源、C/N、pH、温度等都会影响聚磷菌的生长。 因此，有必要考察不同理化因素对富磷细菌生长和除磷能力的影响，对于实现富磷细菌的工程化应用具有重要的参考价值。

菌株ED-12在LB培养基中培养12 h（30℃，150 r·min-1），然后接种到30 mL缺磷培养基中（PO3-4-P质量浓度：12.3 mg·L-） 1）150mL锥形瓶中，在摇瓶中30℃、150r·min-1孵育12h； 然后将菌悬液以接种量5%接种于30mL富磷培养基（PO3-4-P质量）150mL锥形瓶中，浓度为32mg·L-1），摇瓶中培养， 30℃、150r·min-1。 每隔一定时间取样，测定菌株ED-12的OD600和剩余PO3-4-P浓度，计算除磷率并绘制菌株的生长曲线。

根据蓄磷菌的生长特性，以醋酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖和蔗糖为碳源，以NH4Cl、(NH4)2SO4和蔗糖为氮源。 还研究了不同的 C/N 比。 、初始pH值和摇床转速对富磷菌生长和除磷能力的影响。 在优化过程中，将优化后的参数作为后续实验的条件。 另外，在*条件下，通过菌株ED-12对不同初始浓度的PO3-4-P的去除效果来考察其工程应用价值。 PO3-4-P的初始浓度梯度设置为：5、15、30、45、60和100mg·L-1。

2.2.3 微生物固定化颗粒的制备及脱氮除磷初步实验

微生物固定化珠的制备如下：①称取4g PVA（聚合度1750±50），溶解于90mL无菌水中。 PVA完全溶解后，加入2gSA，沸水浴加热至完全溶解，冷却至室温备用； ②分别称取反硝化菌和积磷菌湿菌体2g，用10mL无菌水充分稀释，将稀释后的菌液加入到PVA-SA体系中，充分混匀； ③根据所需菌粒大小，剪断5mL移液器吸头，吸取菌液，匀速滴入5%CaCl2饱和硼酸溶液中。 交联 15 分钟后，用无菌水清洗沉淀并放在一边。

以不加细菌沉淀组为空白对照()，以固定化沉淀未添加微生物组为阳性对照(PVA+SA)。 添加5%（m/V，g·L-1）微生物。 球。 24小时后取样测定水样的TN、TP浓度，并计算脱氮除磷能力。

2.3 测定方法

硝态氮（NO-3）和总氮（TN）采用*分光光度法测定，总磷（TP）采用钼锑分光光度法测定。

2.4 数据处理与统计分析

使用and.5进行数据处理、统计分析和绘图。 所有实验均进行三次，结果表示为平均值±标准差。

3。结果与讨论

3.1 蓄磷细菌的分离与鉴定

3.1.1 富磷菌的分离纯化及复筛

富集后，平板上积磷微生物的菌落随着磷浓度的增加而减少。 当磷浓度达到20 mg·L-1时，平板上无单个菌落。 磷浓度为15 mg·L-1。 将培养基稀释至10-1~10-7并铺于平板上。 根据形态特征，将能在培养基上生长的49个单菌落分为4类，即EA（12株）、EB（15株）、EC（8株）和ED（14株）。 分别对EA、EB、EC、ED进行PHB颗粒染色和异染颗粒染色，初步筛选得到9个染色效果明显的多磷酸菌单菌落（EA、EB）。 ED 各 3 例，EC 未感染）。

随后对EA、EB、ED共9株蓄磷菌进行了重新筛选实验。 缺磷培养12小时后，转移至富磷培养基中，继续培养24小时。 测量除磷率。 结果如表1所示。可以看出，ED-12的除磷能力最强，达到52.2%。 因此，选择菌株ED-12进行进一步研究。

表1 富磷菌除磷能力（初始浓度：33.9 mg·L-1）

3.1.2 多磷酸芽孢杆菌菌株ED-12的PCR扩增及序列分析

测序后，片段长度为的部分基因序列，利用序列分析软件分析其与ED-12序列同源性的可靠性，选出可信度较高的9条序列，利用MEGA4.0软件通过NJ 方法确定 ED-12 的进化状态。 结果如图1所示。

图1 基于序列同源性构建的菌株ED-12与其他密切相关细菌的系统发育树

3.2 ED-12的生长曲线及除磷特性

富磷菌在缺氧缺磷的条件下，会利用异染颗粒中的磷，合成PHB。 当它们转移到好氧、富磷的培养基中时，PHB中的能量就会释放出来，有利于磷的积累。 ，用于细菌生长并将剩余的磷储存在异色颗粒中。 图2显示了菌株ED-12在缺磷培养后在富磷培养基中的生长情况，及其对PO3-4-P去除率的响应。 结果表明，前16小时，细菌生长处于滞后期，16小时后进入对数期，52小时后开始进入衰退期。 整个过程中细菌的生长特性与除磷率的变化趋势基本一致。 64小时内，磷浓度从约30 mg·L-1下降至（8.12±0.32）mg·L-1，去除率达到73.82%±1.02%。 此后，总磷浓度基本保持不变。

图2 菌株ED-12的生长曲线及除磷特性

3.3 不同理化因素对菌株ED-12生长和除磷能力的影响 3.3.1 不同碳源对菌株ED-12生长和除磷能力的影响

有机质的特性是影响生物反应器反硝化除磷效果的重要因素。 与反硝化微生物类似，大多数富磷细菌只能利用低级脂肪酸的小分子有机底物作为碳源，合成PHB作为碳源。 能量形式储存在细胞内。

以醋酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖和蔗糖为碳源，菌株ED-12的生长和除磷能力结果如图3所示。当菌株ED-12以葡萄糖和蔗糖为碳源时，基本上没有不生长，PO3-4-P去除率小于15%。 但以乙酸钠、琥珀酸钠、柠檬酸钠为碳源时菌株生长较好，PO3-4-P的去除率均在50%以上。 其中，以乙酸钠为碳源时，菌株ED-12生长最为旺盛，PO3-4-P的去除率达到70%以上。 比较五种碳源的结构和分子量，相对一般来说，当分子结构简单、分子量较低时，聚磷菌生长较好，能达到较高的除磷率，这与上述观点。 此外，蓄磷细菌使用不同的碳源。 该效果也可能与其自身对碳源的亲和力或其他特性有关。

图3 不同碳源对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

3.3.2 不同氮源对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

氮源是微生物细胞生长的第二大营养物质，对于蛋白质、核酸等成分的合成非常重要。 大多数细菌可以利用氨盐作为第一氮源。 从图4中可以看出，当使用NH4Cl时，(NH4)2SO4积磷菌在以NH4Cl和NH4Cl为唯一氮源的培养基中能够生长良好。 其中，在含有NH4Cl的培养基中，24小时内OD600可达到1.4左右。 同时，在上述3种氮源培养基中，菌株ED-12对PO3-4-P的PO3-4-P去除率均在45%以上（NH4Cl培养基中最高，可达80%）。 结果发现，以NaNO3和NaNO2为唯一氮源培养时，菌株ED-12在24小时时具有较高的去除率。 微生物在培养基中只能微弱生长，但培养48小时后，开始进入对数生长期，可达到较高的OD600。 另外，当NaNO3和NaNO2作为唯一氮源时，虽然微生物生长较差，但培养基中PO3-4-P的浓度分别降低了63.72%±5.57%和34.84%±2.11%分别说明微生物在24小时内主要分解PHB并将磷储存在异染颗粒中供后期细菌生长。 然而研究认为，无论在有氧还是厌氧条件下，NO-2的存在都会抑制蓄磷细菌对磷的吸收。 图4得出了不同的结论，其机制有待进一步研究。 当使用蛋白胨作为*氮源培养基时，菌株ED-12生长较好，但蛋白胨中含有含磷杂质，影响了PO3-4-P去除率的计算。

图4 不同氮源对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

可见，积磷菌ED-12菌株能够在以NH4Cl、NaNO3、NaNO2、(NH4)2SO4、蛋白胨和蛋白胨为第一氮源的培养基中生长。 根据微生物的生长量、生长周期以及对PO3-4-除磷率的响应，NH4Cl是菌株ED-12生长并发挥其除磷能力的氮源。

3.3.3 不同C/N对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

碳源和氮源是微生物生长的重要物质。 不同的微生物对碳源和氮源的需求不同。 细菌对氮源的需求量很大，真菌和放线菌对碳源的需求量很大。 在无毒脱氮除磷过程中，必须考虑C/N，以实现微生物对废水中氮、磷的有效利用。

研究了C/N对富磷菌ED-12生长和除磷能力的影响。 结果（图5）表明，随着C/N的增加，细菌生物量增加，同时PO3-4-P的去除率也增加，在C/N为3:1时达到最大值。 此后，随着C/N的增加，微生物的生长和PO3-4-P的去除率缓慢下降，表明过高的C/N导致氮源不足，从而抑制微生物的生长。

图5 不同C/N对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

3.3.4 不同pH对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

在有氧条件下，积磷细菌可分别利用乙酸和PO3-4作为碳源和磷源，生成聚合磷作为储能材料，储存在细胞内并伴随产生OH-，从而产生聚合磷作为储能材料。发酵液的pH值。 逐渐增加。 磷的积累过程可用式(1)表示。

图6 不同起始pH值对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

3.3.5 不同温度对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

温度是除有机物特性之外影响微生物生长的另一个重要因素。 然而，王亚一等人。 (2006) 和蒋体胜等。 (2007)认为温度不会影响积磷细菌的磷积累功能。

从图7中可以看出，随着温度的升高，尖磷菌ED-12菌株的生物量也随之增加，35℃最适合ED-12菌株的生长。 相应地，ED-12菌株对PO3-4-P的去除率也呈现先增大后减小的趋势，在35℃时达到最大值（73.14%±1.65%）。 由此可见，不同温度对积磷菌ED-12菌株除磷效果的影响相比，其生长影响要大得多。 温度对磷的积累效果有影响，这与等人的研究结果一致。 (2003)，即35℃最有利于聚磷菌的磷积累作用，过高或过低的温度都会抑制其作用。 其效果表明不同的微生物具有不同的磷积累特性。

图7 不同温度对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

3.3.6 不同摇床转速对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

研究表明，溶解氧是影响生物除磷效果的重要因素。 为满足富磷菌生物膜内对氧气的需求，加快氧传递速率，增加活性生物膜的厚度，加快富磷菌的好氧发育。 要提高磷的吸收率，必须提高液体中溶解氧的含量。 另外，低溶解氧有利于反硝化除磷，高溶解氧有利于好氧吸磷（厌氧除磷可在含有硝酸盐或亚硝酸盐的培养物中进行）。 氧气生长）。

如图8所示，当摇床转速在0～200r·min-1之间时，菌株ED-12即可生长。 当摇床转速为50r·min-1时，细菌细胞数较高，达到2.60±0.62； 当振动台转速为100r·min-1时，PO3-4-P的去除率最高，达到59.05%±7.26%。 不同培养条件下，细菌生长和除磷率的趋势不同，表明两者是独立的过程。 在静态培养过程中，储存在异染颗粒中的磷被分解并用于细菌的生长。 此时PO3-4-P去除率接近50%，表明菌株ED-12在厌氧条件下，环境中的磷也可以用于生长。 在有氧条件下，细菌利用部分磷进行生长，并将剩余的磷储存在异色颗粒中。 因此，当转速≥50r·min时，-1也能保持较高的除磷率。 据观察，摇床速度太高可能不会提高除磷率。

图8 不同摇床转速对菌株ED-12生长及除磷能力的影响

固定化微生物反硝化除磷实验（详见3.5节）表明，ED-12菌株在低溶氧和高溶氧条件下均具有除磷或蓄磷作用。 两种效应的强弱导致了这个数字。 结果如图8所示，即高溶解氧下PO3-4-P的去除率与低溶解氧下相似。 当摇床转速为100r·min-1时，ED-12菌株培养基中的溶解氧磷通过反硝化作用去除或储存在异染颗粒中。 在低溶解氧和高溶解氧条件下，分别表现出磷的生长、利用和积累。 因此，通过调节溶解氧可以实现废水中磷的有效去除。 为了实现这一目标，该过程包括生长利用和磷积累。

3.4 菌株ED-12对不同起始浓度PO3-4-P的去除效果

富磷细菌对磷的去除包括两条途径：生长利用和异色颗粒中磷的储存。 根据富磷菌的分离筛选原理，过高浓度的PO3-4-P会抑制富磷菌的生长繁殖。 因此，考察不同PO3-4-P初始浓度对聚磷菌生长的影响以及相应条件下聚磷菌对PO3-4-P的去除效果。 本研究有助于分析聚磷菌生长与聚磷过程的关系，指导聚合过程。 磷酸盐细菌在富营养化水体中​​的工程应用具有现实意义。

如图9所示，随着PO3-4-P浓度的增加，菌株ED-12的OD600呈现先增加后减少的趋势。 当PO3-4-P浓度为45 mg·L-1时，菌株ED-12，过量的PO3-4-P会抑制细菌的生长。 这是由于基质对微生物生长的自抑制作用所致，与聚磷菌分离筛选的结论一致。 结果表明，除5 mg·L组-1外，随着PO3-4-P浓度的增加，ED-12菌株对PO3-4-P的去除率与蓄磷菌生物量呈正相关。 （图中未显示），但 PO3-4-P 浓度的变化始终呈现增加趋势。 当PO3-4-P浓度>45mg·L-1时，培养基中出现一些沉淀。 正如3.3.4节所总结的，磷积累过程会释放出OH-，微生物生长速度越快，同一时间内产生的OH-就越多。 因此，更多的PO3-4-P形成沉淀，合理地解释了上述现象。 上述结论表明，ED-12对磷的吸收是一个复杂的过程。 细菌的生长和磷的积累过程中，不仅受到物理和化学因素特别是pH的影响，溶液中的磷浓度也是影响积累磷的细菌的生长和磷的效果的关键因素积累。 由上述分析可以看出，菌株ED-12具有很强的去除PO3-4-P的能力。 在PO3-4-P不同起始浓度梯度条件下，最高去除率可达81.02%±2.27%。 此时PO3-4-P浓度变化为(36.46±1.02)mg·L-1。

图9 菌株ED-12对不同起始浓度PO3-4-P的去除效果

表2为典型积磷菌在不同起始浓度下对PO3-4-P的去除效果。 从表中可以看出，除耳葡萄球菌（laris）外，

表2 不同微生物除磷效率

微生物PO3-4-P起始浓度/

(mg·L-1) PO3-4-P去除率参考

*()1065% 南亚平等，2013

耳葡萄球菌 (laris)50>90%.,2000

肠杆菌(.)10.2594.6% 张培宇等，2011

&.3>80%.,2005

克雷伯氏菌 ()27

约氏不动杆菌 (ii) 1065.24% 连丽丽, 2009

产碱菌(.)7.590%刘亚楠等，2005

产碱菌(.)10>90%.,2007

产碱菌(.)20.2582.3% 孙萌, 2011

产碱菌(.)28.7377.1% 焦忠志等, 2009

产碱菌(.)4581%这项研究

3.5 固定化磷聚合物微生物珠脱氮除磷实验

微生物的固定化是实现微生物活性保留的方法之一。 同时，固定化也有助于目标微生物的添加和回收。 目前应用最广泛的固定化材料是*和海藻酸盐，固定化交联剂通常选用2%~5%的CaCl2饱和硼酸溶液。

根据赖子妮等人的实验配方制备了固定化磷聚合物微生物颗粒。 (2008)具有良好的弹性和机械强度。 对含氮磷废水的净化效果表明，该颗粒除磷能力较强（由（19.91±1.81）mg·L-1降至（6.19±0.76）mg·L-1），且在同时还能去除一定量的氮（由（215.82±35.29）mg·L-1降至（183.42±15.35）mg·L-1）（图10a）。 两者的去除率分别达到56.21%和15.01%（图10b）。 其中，固定化材料对氮的吸附比例较小，而对磷的吸附则较为显着（p

图10 固定化磷聚合物微生物珠的脱氮除磷效果

4。结论

1）本研究成功从高崎村污水口中筛选出一株典型的富磷微生物菌株。 经鉴定，发现其属于产碱菌属(.)，并命名为ZGED-12。

2）研究发现菌株ED-12可以在高磷浓度下生长，16小时进入对数生长期。 物理和化学因子的实验确定了磷添加细菌ED-12的最佳生长和磷的去除能力，其中碳源，氮源和pH值对其具有最大的影响。 磷浓度实验表明，低浓度的磷不利于ED-12菌株的生长，但是过高的浓度会抑制细菌的生长和磷积累的功能。 *磷浓度为45mg·L-1。

3）这项研究成功地实现了磷酸化微生物的固定化。 固定的珠子对去除氮和磷显示出良好的影响。 作用机理包括通过固定材料对氮和磷的物理和化学吸附，以及微生物（或储存）的吸收和利用。 其中，微生物在此过程中起着关键作用。