产生莨菪烷生物碱(TA)的非植物宿主细胞及其制备和使用方法与流程

[0148]

在一些情况下，宿主细胞是包括细胞的一个或多个生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制缓解突变（例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、甚至更多个）的细胞。在一些情况下，一个或多个生物合成酶基因是细胞固有的（例如，存在于未修饰的细胞中）。如本文所用，术语“反馈抑制缓解突变”是指缓解宿主细胞的反馈抑制控制机制的突变。反馈抑制是细胞的控制机制，其中当受调控化合物积累到一定水平时，抑制该化合物合成途径中的酶，从而平衡细胞中化合物的量。在一些情况下，一个或多个反馈抑制缓解突变在图1中

‑

4 或图 8 示意图中所示的酶。缓解反馈抑制的突变降低了目标细胞中受调控酶相对于对照细胞的抑制，并提高了受调控化合物或其下游生物合成产物的水平。在某些情况下，缓解受调控酶的抑制是指抑制

增加2倍以上，例如增加3倍以上、5倍以上、10倍以上、30倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上，甚至更多。增加的水平是指受调控化合物或其下游产物在对照细胞中的水平为110％以上，例如增加120％以上、130％以上、140％以上、150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上，或增加200％以上，例如增加至少3倍以上、至少5倍以上、至少10倍以上，甚至更多。

[0149]

可以靶向宿主细胞中旨在调节 TA 前体水平的多种反馈抑制控制机制和宿主细胞固有的生物合成酶以进行缓解。宿主细胞可以包括一个或多个反馈抑制缓解突变，这些突变位于细胞固有的一个或多个生物合成酶基因中。突变可以位于宿主细胞固有的任何方便的生物合成酶基因中，其中生物合成酶受到调节。在一些实施方案中，一个或多个生物合成酶基因编码一种或多种选自以下的酶：鸟氨酸脱羧酶 (ODC)、鸟氨酸脱羧酶抗酶 (OR) 和腐胺。

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在一些实施方案中，所述一种或多种生物合成酶基因编码鸟氨酸脱羧酶。在一些情况下，所述一种或多种生物合成酶基因编码鸟氨酸脱羧酶抗酶。在一些实施方案中，所述一种或多种生物合成酶基因编码腐胺。

‑

甲基转移酶。在一些情况下，在选自spe1、oaz1和pmt的生物合成酶基因中存在一个或多个反馈抑制缓解突变。在一些情况下，在spe1的生物合成酶基因中存在一个或多个反馈抑制缓解突变。在一些情况下，在oaz1的生物合成酶基因中存在一个或多个反馈抑制缓解突变。在一些情况下，在pmt的生物合成酶基因中存在一个或多个反馈抑制缓解突变。在一些实施例中，宿主细胞在一个或多个生物合成酶基因(例如表1中描述的基因之一)中包含一个或多个反馈抑制缓解突变。

[0149]

可以使用任何方便数量和类型的突变来减轻反馈抑制控制机制。如本文所用，术语“突变”是指相对于参考序列或基序缺失、插入或替换一个或多个氨基酸残基或一个或多个核苷酸残基。突变可以作为原始基因座处的天然基因的定向突变而引入。在某些情况下，突变可以作为基因的额外拷贝（作为单独基因座处的遗传整合引入）或作为额外载体（例如

在某些情况下，酶的反馈抑制拷贝处于天然细胞的转录控制之下。在某些情况下，酶的反馈抑制拷贝是通过将酶置于合成启动子的控制之下来引入的，并对蛋白质表达进行工程化的组成性或动态控制。

[0151]

在某些实施例中，本发明的宿主细胞可包括1个或多个、2个或多个、3个或多个、4个或多个、5个或多个、6个或多个、7个或多个、8个或多个、9个或多个、10个或多个、11个或多个、12个或多个、13个或多个、14个或多个、甚至15个或更多个反馈抑制缓解突变，例如在宿主细胞天然的一个或多个生物合成酶基因中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个反馈抑制缓解突变。

[0152]

转录调控修饰

[0153]

宿主细胞可包括一个或多个细胞生物合成酶基因的转录调控修饰(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、甚至更多个修饰)。在某些情况下，一个或多个生物合成酶基因是细胞固有的。任何方便的细胞生物合成酶基因都可以作为转录调控的目标。转录调控是指调节修饰细胞中感兴趣的基因的表达，例如，相对于对照细胞(例如，未修饰细胞)增加或减少、增强或抑制。在某些情况下，感兴趣的基因的转录调控包括增加或增强表达。在某些实施方案中，增加或增强表达是指与对照(即，在未修饰的相同细胞中表达)相比增加2倍或更多，例如5倍或更多，有时增加25、50或100倍或更多，以及300倍或更多或更多(例如，通过使用任何方便的基因表达测定)。或者，在细胞中目的基因表达低至不可检测的情况下，如果表达增加至可以容易检测的水平，则认为目的基因的表达水平增加。在某些情况下，目的基因的转录调控包括降低或抑制表达。降低或抑制表达是指与对照相比，目的基因的表达水平降低2倍或更多，例如5倍或更多，有时降低25倍、50倍或100倍或更多，在某些实施方案中降低300倍或更多或更高。在某些情况下，表达降低至不可检测的水平。适用于所述宿主细胞的目的基因的宿主细胞过程的改进描述于等人的美国公开号(14/211,611)中，其公开内容通过引用整体并入本文中。

[0154]

任何方便的生物合成酶基因都可以受到转录调控，包括但不限于 FIG1

‑

3，例如arg2、car1、spel、fms1、pha2、aro8、aro9和ugp1。在一些情况下，所述一种或多种生物合成酶基因选自arg2、car1、spel和fms1。在一些情况下，所述一种或多种生物合成酶基因为arg2。在一些情况下，所述一种或多种生物合成酶基因为car1。在一些实施例中，所述一种或多种生物合成酶基因为spel。在一些实施例中，所述一种或多种生物合成酶基因为fms1。在一些实施例中，宿主细胞包含对一个或多个基因的一种或多种转录调控修饰，例如表1中描述的基因之一。在一些实施例中，宿主细胞包含对一个或多个基因的一种或多种转录调控修饰，例如表1中描述的基因之一。

‑

4或图8示意图中所示的基因之一）。

[0155]

在一些实施方案中，转录调控修饰包括用强启动子替换一个或多个生物合成酶基因的天然启动子或在强启动子的控制下表达一个或多个基因的一个或多个额外拷贝。驱动目的基因表达的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，只要该启动子可以在宿主细胞中活跃即可。目的基因可以由其天然启动子表达，或者可以使用非天然启动子。虽然不是必需的，但此类启动子在使用它们的宿主中应具有中等至高强度。启动子可以是受调控的或组成型的。在一些实施方案中，使用不受葡萄糖抑制或由培养基中的葡萄糖激活的启动子。

有些启动子仅受到轻度抑制。有许多合适的启动子，例如糖酵解基因的启动子，例如枯草芽孢杆菌的tsr基因启动子(编码果糖二磷酸醛缩酶)或酿酒酵母的gapdh启动子(编码甘油醛3-4-磷酸醛缩酶)。

‑

磷酸脱氢酶）（GA，Meth.152:673 684 (1987)）。其他感兴趣的强启动子包括但不限于面包酵母的 Adhi 启动子（L. et al.，J.39:193 203 (1995)）、磷酸饥饿诱导启动子，例如酵母 Pho5 启动子（A. et al.，in Yeast，Barr，PJ et al.，ed.，（1989）、地衣芽孢杆菌（B.）的碱性磷酸酶启动子（Lee. Jwk et al.，J.Gen.137:1127 1133 (1991)）、Gpd1 和 Tef1。感兴趣的酵母启动子包括但不限于诱导启动子，例如 Gal1

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10. gal1、gall、gals、抑制启动子met25、teto和组成型启动子，如甘油醛3

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磷酸脱氢酶启动子（gpd）、乙醇脱氢酶启动子（adh）、翻译延长因子1

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α启动子 (tef)、细胞色素c

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氧化酶启动子 (cyc1)、mrp7启动子、磷酸甘油酸激酶 (pgk)、磷酸丙糖异构酶 (tpi) 等。在某些情况下，强启动子是 gpd1。在某些情况下，强启动子是 tef1。包含激素诱导启动子（例如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素）的自复制酵母表达载体也是已知的，包括但不限于糖皮质激素反应元件 (gre) 和甲状腺激素反应元件 (tre)，参见例如美国专利号 7,045,290 中描述的那些启动子。可以使用含有组成型或诱导型启动子（例如 α 因子、酒精氧化酶和 pgh）的载体。此外，任何启动子/增强子组合（根据真核启动子数据库 (data base, epdb)）也可用于驱动目的基因的表达。应该理解的是，可以选择任何对宿主细胞（例如大肠杆菌）特异的方便的启动子。在某些情况下，启动子的选择可用于优化转录，从而优化酶水平以最大化产量，同时最小化能源资源。

[0156]

失活突变

[0157]

宿主细胞可以包括该细胞的酶的一个或多个失活突变(例如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、甚至更多个)。包括一个或多个失活突变可以改善宿主细胞的合成途径的通量，从而增加目的TA或生产TA的所需酶或前体的水平。在某些情况下，一个或多个失活突变是针对细胞固有的酶的。图8显示了作用于酵母中多胺生产途径的天然调控机制，图9显示了这些天然调控系统的破坏对腐胺生产的影响。如本文所用，“失活突变”是指细胞的基因或调控DNA序列的一个或多个突变，其中一个或多个突变使目的基因表达的蛋白质的生物活性失活。在某些情况下，该基因是细胞固有的。在某些情况下，基因编码酶，该酶是失活的并且是宿主细胞产生的目标TA的合成途径的一部分或与其相连。在某些情况下，失活突变位于控制目标基因的调节DNA序列中。在某些情况下，失活突变是针对基因的启动子的。任何方便的突变(例如，如本文所述)都可用于使目标基因或调节DNA序列失活。“失活”或“失活……”是指突变基因表达的蛋白质的生物活性相对于未突变对照基因表达的对照蛋白质降低10％或更多，例如20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多或99％或更多。在某些情况下，蛋白质是一种酶，失活突变会降低酶的活性。

[0158]

在一些实施方案中，细胞包括细胞固有的酶的失活突变。任何方便的酶都可以作为失活的目标。感兴趣的酶包括但不限于 FIG1

‑

4、8、11、22和41，其在宿主细胞的生物合成途径中的作用倾向于降低目标TA的水平。在某些情况下，该酶具有甲硫腺苷磷酸化酶活性。在某些实施方案中，包含失活突变的酶是meul（参见例如图8、9和13）。

在一些情况下，所述酶具有鸟氨酸脱羧酶抗酶活性。在某些实施例中，包含失活突变的酶是oaz1。在一些情况下，所述酶具有亚精胺合酶活性。在某些实施例中，包含失活突变的酶是spe3。在一些情况下，所述酶具有精胺合酶活性。在一些实施例中，包含失活突变的酶是spe4。在一些情况下，所述酶是具有多胺外排转运活性的膜转运蛋白（）。在某些实施例中，包含失活突变的酶或蛋白质是tpo5。在一些情况下，所述酶具有苯丙烯酸脱羧酶活性。在某些实施例中，包含失活突变的酶是pad1。在一些情况下，所述酶具有醇脱氢酶活性。在一些实施例中，包含失活突变的酶选自adh2、adh3、adh4、adh5、adh6、adh7和sfa1。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是adh2。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是adh3。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是adh4。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是adh5。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是adh6。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是adh7。在某些情况下，该酶具有醛氧化还原酶活性。在某些实施例中，包含失活突变的酶选自hfd1、ald2、ald3、ald4、ald5和ald6。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是hfd1。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是ald2。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是ald3。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是ald4。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是ald5。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是ald6。在一些情况下，该酶具有葡萄糖苷酶活性。在某些实施例中，包含失活突变的酶选自exg1、spr1和eggh1。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是exg1。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是spr1。在某些实施例中，包含一个或多个失活突变的酶是eggh1。在一些实施例中，宿主细胞包含表1中描述的一个或多个基因的一个或多个失活突变。

[0159]

利用酰基转移酶的功能表达在非植物宿主中进行TA酰基转移反应的方法

[0159]

本文提供的一些方法、工艺和系统描述了非植物细胞中一种或多种含有酰基供体基团的TA前体与一种或多种含有酰基受体基团的TA前体的协同反应，以产生一种或多种TA（以下称为TA酰基转移反应）。这些方法、工艺和系统中的一些可能包括工程化的宿主细胞。在某些情况下，TA酰基转移反应是将底物转化为各种生物碱的关键步骤。在某些情况下，TA酰基转移反应包括缩合反应。

[0161]

在一些情况下，ta酰基转移可能涉及至少一个缩合反应。在一些情况下，至少一个缩合反应是在酶存在下进行的。在一些情况下，至少一个缩合反应由酶催化。在一些情况下，至少一种酶可用于催化缩合反应。

[0162]

在本文描述的一些方法、工艺和系统中，缩合反应可以在酶的存在下进行。在一些实例中，酶可以是酰基转移酶。酰基转移酶可以使用具有醇或羧酸盐官能团的ta作为底物。酰基转移酶可以使用1-羟基-...

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以β-糖苷键上羧基被活化的TA为底物，酰基转移酶可将TA醇和羧基/糖苷功能基团转化为相应的酯衍生物，本发明中适用于TA前体缩合的酶的非限制性例子包括丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶(SCP1)。

‑

例如，利托林合酶（ec 2.3.1.

‑

) 可用于将托品和其他含有醇类官能团的 TA 前体与 1 反应

‑

苯乳酸

‑

葡萄糖和其他TA糖苷前体缩合成利他林和其他相应的酯产物。在一些实施例中，包含上述任何实施例的scpl

‑

在域蛋白可以浓缩。在一些例子中，scpl

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可以催化宿主细胞（例如工程宿主细胞）中的缩合反应，如本文所述。在其他实例中，scpl

‑

可以催化宿主细胞

亚细胞区室内（如工程宿主细胞）的缩合反应，如本文所述。

[0163]

在本发明的一些实施例中，采用了进行ta酰基转移反应的酰基转移酶(如scpl)。

‑

一个或多个修饰可改变酶的翻译后加工、运输、折叠、寡聚化和/或亚细胞定位。

‑

AT 酶从未在活的非植物细胞中表现出催化活性，因此这种修饰可能被证明是有用的，或者可能是在非植物宿主细胞中发挥活性所必需的。这种修饰的例子包括但不限于：添加、移除或替换 N 端信号肽序列；添加、移除或替换内部前肽序列；添加或移除天冬酰胺连接的 N

‑

糖基化位点；添加或删除丝氨酸连接的 o

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糖基化位点；以及蛋白质结构域与酰基转移酶结构域的N-和/或C-端的融合。

[0164]

在本发明的一个实施例中，scpl

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AT 酶结构域在其 N 端通过与可溶性蛋白结构域融合而得到修饰。该可溶性结构域掩盖了酰基转移酶结构域中的任何内部信号序列，从而改善了融合蛋白

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在一些实施方案中，N末端融合结构域诱导scpl

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AT 结构域被转运至亚细胞区室，包括但不限于 ER 膜、ER 腔、顺式高尔基体、反式高尔基体、溶酶体、液泡膜和液泡腔。N 端融合的可溶性结构域还可以转运 scpl

‑

at结构域的寡聚状态从其天然状态(单体)改变为任何状态，包括但不限于同二聚体、异二聚体、同三聚体、异三聚体、同四聚体、异四聚体、同六聚体、异六聚体、同八聚体、异八聚体或更高程度的寡聚化。

[0165]

在一个实例中，N 端融合的可溶性蛋白结构域是选自包括但不限于来自水母属（）物种的荧光蛋白和来自香菇属（）物种的荧光蛋白的荧光蛋白。在一个实例中，N 端融合的可溶性蛋白结构域是来自香菇属物种的红色荧光蛋白（dsred）。在其他实例中，N 端融合的可溶性蛋白结构域是 TA 生物合成途径中的另一种酶，包括但不限于鸟氨酸脱羧酶、腐胺、n

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甲基转移酶、吡咯烷酮合酶、托品酮还原酶、苯丙酮酸还原酶、苯乳酸UDP

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葡萄糖基转移酶84a和东莨菪碱脱氢酶。

[0166]

可与 scpl 一起使用

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表 3 提供了与 AT 结构域的 N 端融合的可溶性蛋白质结构域的氨基酸序列示例（然后可用于在非植物细胞中进行 TA 酰基转移反应）。

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所述酶的氨基酸序列可以与表3中列出的给定氨基酸序列具有50％或更多的同一性。例如，这种酰基转移酶的氨基酸序列可以包括与本文提供的氨基酸序列具有至少50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、86％或更多、87％或更多、88％或更多、89％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多同一性的氨基酸序列。此外，在某些实施方案中，“相同”氨基酸序列包括在氨基酸水平上与特定氨基酸序列至少 80％相同的氨基酸序列。

‑

在某些情况下，“相同”氨基酸序列至少包含约 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94% 或更多，在某些情况下，在氨基酸水平上至少包含 95%、96%、97%、98% 和 99% 的相同性。在某些情况下，氨基酸序列可能相同，但 DNA 序列被改变，例如，为了优化宿主生物的密码子使用。

[0167]

可以提供产生催化TA酰基转移反应的酰基转移酶的工程化非植物宿主细胞，其中酰基转移酶包含在其N末端与选自表3中的那些序列的组的可溶性蛋白质结构域的氨基酸序列融合的氨基酸序列。可以回收和纯化工程化宿主细胞中产生的酰基转移酶以形成生物催化剂。从产生酰基转移酶的工程化宿主细胞中回收的一种或多种酶可用于生物催化剂中以进行TA酰基转移。

该方法可以包括将具有醇和/或羧酸/糖苷官能团的TA前体与酰基转移酶接触，所述酰基转移酶的量足以将醇和/或羧酸/糖苷基团转化为相应的酯基团。在一个示例中，具有醇和/或羧酸/糖苷官能团的TA前体可以与足够量的一种或多种酶接触，以将至少5％的TA前体转化为相应的酯。在进一步的实例中，具有醇和/或羧酸盐/糖苷官能团的TA可以与足够量的一种或多种酶接触，使得至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％或100％的TA前体被转化为相应的酯。

[0168]

可用于进行 TA 酰基转移反应的一种或多种酶可在体外接触 TA 前体。另外或替代地，可用于进行 TA 酰基转移反应的一种或多种酶可在体内接触 TA 前体。此外，可用于进行 TA 酰基转移反应的一种或多种酶可提供给其中具有 TA 前体的细胞，或者可在工程化非植物宿主细胞中产生该酶。

[0169]

在一些实例中，该方法提供了产生生物碱产物的工程化非植物宿主细胞，其中TA酰基转移反应可构成生物碱产物生产中的关键步骤。在一些实例中，产生的生物碱是药用TA。在其他实施例中，产生的生物碱源自药用TA，包括例如非天然TA。在其他实施例中，生物碱产物选自药用TA、非药用TA和非天然TA。

[0169]

在一些实例中，底物是选自由托品、假托品、芽子碱、甲基芽子碱、苯乳酸、肉桂酸、阿魏酸、香豆酸和所列化合物的糖苷组成的组的ta前体。

[0169]

在一些实例中，该方法提供了托品和 1

‑

工程化非植物宿主细胞用于从苯乳酰葡萄糖生产生物碱产品。托品和 1

‑

苯基乳酰葡萄糖缩合为利托林可构成从前体生产各种生物碱产品的关键步骤。在一些实施方案中，前体是 l

‑

氨基酸或糖（例如葡萄糖）。各种生物碱产品可能包括但不限于药用TA、非药用TA和非天然TA。

[0169]

任何合适的碳源都可以用作ta酰基转移反应的前体。合适的前体可以包括但不限于单糖（例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖）、寡糖（例如乳糖、蔗糖、棉子糖）、多糖（例如淀粉、纤维素）或其组合。在一些实例中，可以使用来自可再生原料（例如玉米糖浆、甜菜糖蜜、大麦麦芽、生物质水解物）的未纯化混合物。在其他实施例中，碳前体可以是一碳化合物（例如甲醇、二氧化碳）或二碳化合物（例如乙醇）。在其他实施例中，可以使用其他含碳化合物，例如甲胺、葡萄糖胺和氨基酸（例如

‑

精氨酸和L

‑

在一些实例中，可以将具有醇和/或羧酸盐/糖苷功能团的TA或TA前体直接添加到本发明的工程宿主细胞中，包括例如托品碱、假托品碱、芽子碱、甲基芽子碱、苯乳酸、肉桂酸、阿魏酸、香豆酸和所列化合物的糖苷。

[0173]

在一些实施方案中，进行液泡ta酰基转移反应的底物可以含有一个或多个醇和/或羧酸盐/糖苷官能团，其中只有一个官能团与相应的酯缩合。

[0174]

塔醇

‑

醛类相互转化

[0175]

本文提供的一些方法、工艺和系统描述了具有醛官能团的TA向具有醇（羟基）官能团的TA的转化，以及具有醇官能团的TA向具有醛官能团的TA（以下称为TA醇）的转化。

‑

醛相互转化）。这些方法、过程和系统中的一些可能包括工程宿主细胞。在一些例子中，ta 醇

‑

醛基相互转化是底物转化为各种生物碱的关键步骤。在某些情况下，醛基转化为醇基

还原包括还原反应。在某些情况下，底物TA醛还原为醇可以通过将醛底物还原为相应的四面体氧阴离子中间体，然后将该中间体质子化为羟基来进行，如图2所示，并一般性地表示在方案1中。如方案1所示，R1可以是H、CH3或更高级烷基；R2和R3可以是H、OH或OC3；R4可以是H；并且R5可以是H、OH、C1-

C4 烷基，C1‑

C4 烷氧基，C1-

C4 酰基、F、Cl 或 Br。

[0176][0177]

方案 1

[0178]

在一些例子中，ta 酒精

‑

醛的相互转化可能涉及至少一种氧化反应或至少一种还原反应。在某些情况下，至少一种氧化或还原反应是在酶存在下进行的。在某些情况下，至少一种氧化或还原反应是由酶催化的。在某些情况下，氧化和还原反应都在至少一种酶存在下进行。在某些情况下，至少一种酶可用于催化氧化和还原反应。氧化和还原反应可以由同一种酶催化。

[0179]

在本文描述的一些方法、工艺和系统中，氧化或还原反应可以在酶的存在下进行。在一些实例中，酶可以是脱氢酶。脱氢酶可以使用具有醇或醛官能团的TA作为底物。脱氢酶可以将TA醇或醛官能团转化为相应的醛或醇衍生物。脱氢酶可以称为莨菪碱脱氢酶（HDH）。本公开内容中适合氧化和/或还原TA的酶的非限制性实例包括细胞色素P450氧化酶、2

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氧戊二酸依赖性氧化酶、黄素蛋白氧化酶、短链脱氢酶

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还原酶（sdr）、中链脱氢酶

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还原酶 (mdr)、肉桂醇脱氢酶 (cad) 和醛

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酮还原酶 (AKR)。例如，托品酮还原酶 1 (EC 1.1.1.206) 可以将托品酮和其他具有酮基官能团的 TA 前体氧化为托品 (3α

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在一些实例中，包含上述任一实例的脱氢酶结构域的蛋白质可被氧化或还原。在一些实例中，脱氢酶可催化宿主细胞（例如工程化宿主细胞）中的氧化和/或还原反应，如本文所述。

[0179]

可用于TA

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表2提供了醛相互转换脱氢酶的氨基酸序列的例子。

‑

醛相互转化脱氢酶的氨基酸序列可与表2中列出的给定氨基酸序列具有50％或更多的同一性。例如，这种脱氢酶的氨基酸序列可包含与表2中列出的给定氨基酸序列具有至少50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、86％或更多、87％或更多、88％或更多、89％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或99％或更多同一性的氨基酸序列。如本文所提供的氨基酸序列。此外，在某些实施方案中，“相同”氨基酸序列包括在氨基酸水平上与特定氨基酸序列至少 80％相同的氨基酸序列。

‑

[0181]

可以提供产生催化醇的工程宿主细胞

‑

本发明涉及醛相互转化脱氢酶，其中所述脱氢酶包含选自表2中的那些序列的氨基酸序列。在工程宿主细胞中产生的脱氢酶

脱氢酶可以回收并纯化以形成生物催化剂。从产生脱氢酶的工程宿主细胞中回收的一种或多种酶可用于生产ta-醇。

‑

该方法可以包括将具有醇和/或醛官能团的TA与脱氢酶接触，脱氢酶的量足以将TA的醇和/或醛基团转化为相应的醛和/或醇基团。在一个例子中，可以将具有醇和/或醛官能团的TA与足够量的一种或多种酶接触，使得至少5％的TA转化为其相应的醛和/或醇基团。在进一步的实例中，具有醇和/或醛官能团的TA可以与足够量的一种或多种酶接触，使得至少 10％、至少 15％、至少 20％、至少 25％、至少 30％、至少 35％、至少 40％、至少 45％、至少 50％、至少 55％、至少 60％、至少 65％、至少 70％、至少 75％、至少 80％、至少 82％、至少 84％、至少 86％、至少 88％、至少 90％、至少 91％、至少 92％、至少 93％、至少 94％、至少 95％、至少 96％、至少 97％、至少 98％、至少 99％、至少 99.5％、至少 99.7％或 100％的TA转化为其相应的醛和/或醇基团。

[0182]

可用于TA

‑

一种或多种将醛相互转化的酶可在体外与TA接触。此外或备选地，TA醇可用于

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在体内，一种或多种将醛相互转化的酶可以与TA接触。此外，还可以使用一种或多种可以将TA相互转化成醇的酶。

‑

向其中含有ta的细胞提供一种或多种用于醛相互转化的酶，或者可以在工程宿主细胞内产生这些酶。

[0183]

在一些实例中，该方法提供了产生生物碱产物的工程宿主细胞，其中ta醇

‑

醛的相互转化可构成生物碱产品生产的关键步骤。在某些情况下，产生的生物碱是药用TA。在其他实施例中，产生的生物碱源自药用TA，包括例如非天然TA。在另一个实施例中，具有醇和/或醛官能团的TA是工程宿主细胞产物的中间体。在其他实施例中，生物碱产品选自药用TA、非药用TA和非天然TA。

[0184]

在一些实例中，所述底物是ta或ta的前体，选自利他林、莨菪醛、莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱组成的组。

[0185]

在一些实例中，该方法提供了一种工程化的宿主细胞，该宿主细胞从东莨菪碱中产生生物碱产物。东莨菪碱还原为莨菪碱可构成从前体生产各种生物碱产物的关键步骤。在一些实例中，前体是

‑

氨基酸或糖（例如葡萄糖）。各种生物碱产品可能包括但不限于药用TA、非药用TA和非天然TA。

[0186]

任何合适的碳源都可以用作醇

‑

甲基苯丙胺可转化成适当的前体，包括但不限于单糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、寡糖(例如乳糖、蔗糖、棉糖)、多糖(例如淀粉、纤维素)或其组合(例如大麦芽、生物质水解)。在其他实施例中，碳可为碳化合物(例如甲醇、二氧化碳)或二碳化合物(例如乙醇)。

苍凉

精氨酸和L

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苯丙氨酸) 在一些情况下，TA或TA的前镜可以直接添加到本发明的工程宿主细胞中，包括例如，例如伪-伪

[0187]

在一些实施方案中，它用于进行TA醇

苍凉

互相转化的底物可能含有一种或多种醇和/或醛，其中正式功能基团中只有一个被氧化或还原为相应的醛或醇基团。

[0188]

用于增加细胞内外代谢物的转移

[0189]

本文提供的一些方法、流程和系统描述了利用蛋白质（以下称为“转运蛋白”）进行代谢跨脂质膜转译（以下简称“跨膜转移”）。

[0190]

在一些实施方案中，宿主细胞包括脂质膜和一种或多种转运蛋白的活性编码序列或其活性片段，所述转运蛋白或转运蛋白构成TA或TA前隔膜。在其他情况下，脂质膜是细胞膜。

[0191]

在某些情况下，以这种方式转移的TA和TA前体包括但不限于鱼精胺、N

苍凉

甲沙利定，4

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腹氨基果胶醛，N

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甲基吡咯烷酮、甲基苯丙酮、苯乳酸酯、1

苍凉

苯乳酸葡萄糖、利他林、钠胺、山他达林和东藤碱的积累。物种或多种转运蛋白的异源编码序列在宿主细胞中的表达可增加TA或TA前沿的产生。

[0192]

在一些实施方案中，转移蛋白或其活性片段是多药物和毒素。 Mate 可用于运输上述 TA 或 TA 前列中的任何方便的 Mate 转运蛋白。 1（）、普通烟草 Mate1、普通烟草 Mate2，或表 1 和表 4 中描述的任何其他蛋白质。

[0193]

在一些实施方案中，转移蛋白或其活性片段是硝酸盐/肽家族(NPF)转移蛋白。在主题宿主细胞中可以使用一种或多种上述TA或TA前体中的任何方便的NPF转移蛋白。

[0194]

在一些实施方案中，宿主细胞包括转移蛋白或其活性片段的异质编码序列，末端、 C末端或内部信号序列；添加、移除、替换、或重新排出跨膜螺旋；以及蛋白质结构域与蛋白质结构域的 N 端和 / 或 C 端的融合。

[0195]

可用于减少在特定细胞区域中积累的转运蛋白的氨基酸序列的实例，以限制和/或增加在特定细胞区域中的底物转移。所述蛋白质的氨基酸序列可以包括至少50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、81％或更多、83％或更多、84％或更多、84％或更多、85％或更多。至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、99% 或更多的氨基酸序列在氨基酸水平上相同。此外，在一些实施方案中，“相同”氨基酸序列在氨基酸水平上包含至少 80%的特定氨基酸序列和特定氨基酸序列。

苍凉

99％的性质相同。在某些情况下，“相同”的氨基酸序列至少包含约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或更多。至少95％、96％、97％、98％和99％在某些情况下，氨基酸序列可以相同，但DNA序列发生变化，例如针对宿主生物优化密码子。

[0196]

可以提供工程非植物宿主细胞，其从一个薄层中产生一个或多个TA或TA前体

1.14.14.

苍凉

酶如表1所述。

[0205]

在一些实施方案中，宿主细胞包括具有膨润土还原酶活性的酶或活性片段的异源编码序列。

[0206]

在一些情况下，宿主细胞包括苯乙酰辅酶（PPR）活性序列。

[0207]

在一些实施方案中，宿主细胞包含苯乳酸糖基酶活性。

苍凉

酶，葡萄糖部分通过糖苷键通过 udp 被利用

苍凉

葡萄糖转移到苯基乳酸，如表 1 所述。

[0208]

在一些实施方案中，细胞包括支持产品的支撑和1

苍凉

苯基乳酸葡萄糖转化为一种或多种酶的一个或多个编码序列或其的活性片段。C 2.3.1。

苍凉

如表1中所述的酶，以及表3中所述的含有可溶性蛋白质结构域的酶。在一些实施方案中，宿主细胞包括或其活性片段的异质编码序列。

[0209]

在某些情况下，宿主细胞包括的活性。

苍凉

酶如表1所述。

[0210]

在一些实施方案中，宿主细胞包括碱性脱氢酶（HDH）活性。

[0211]

在某些实施方案中，宿主细胞包括6β

苍凉

羟化酶/双加氧酶 (H6H) 活性。任何方便的 H6H 酶均可用于主题宿主细胞。

[0212]

在一些情况下，工程宿主细胞包含多个编码跨膜代谢物转运蛋白的异源编码序列，编码的多个转运蛋白中的一些可以重复拷贝。

[0213]

本文所用的术语“异源编码序列”也包括肽或酶的编码部分，即肽或酶的cDNA或mRNA序列，以及全长转录单位的编码部分，即内、外部子序列的基因，以及酶的“密码优化”序列或等效氨基酸序列的“密码优化”序列。等效氨基酸序列产生功能性蛋白质的前提是保持催化活性。

还包括一个或多个酶或催化结构域与一个或多个非催化蛋白结构域的融合，其融合方法使得有利于融合的非催化结构域的溶解性、折叠、成熟度和/或活性与有利于融合的催化结构域的融合。

[0214]

可以通过建模和/或筛选来鉴定操作片段、突变体或短期形式。酶的等效衍生物。

[0215]

本发明的方面还涉及编码与各种酶等价的氨基酸序列的异源编码序列。与特定氨基酸序列的类似活性相比，这种改变不会影响蛋白质的生物活性。在一些实施方案中，“等价”的氨基酸序列是在氨基酸水平上，并且特定氨基酸在某些实施方案中至少包含80％

苍凉

99%的相同性至少在氨基酸水平上约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%等。序列可以相同，但DNA序列改变，例如优化如宿主生物的密码子。

[0216]

宿主细胞也可以被改