继“铁死亡”后，“铜死亡”也来了！
相信各位科研朋友的朋友圈这几天都快被“铜的消亡”刷爆了，不少同学早已翻遍元素周期表，心里默念着“钠、镁、铝、硅、磷、硫、氯、氩、钾、钙……铁、钴、镍、铜、锌……”。
细胞死亡也是机体发育过程中非常重要的一个步骤，机体通过诱导受损、衰老或冗余细胞死亡来保证机体内微环境的健康稳定。目前，已发现多种程序性和非程序性细胞死亡形式，包括细胞凋亡、铁死亡和坏死性凋亡。铜作为必需酶辅因子的需要已在整个动物界得到认可，从细菌到人体细胞。然而，跨浓度梯度起作用的主动稳态机制将细胞内铜浓度保持在非常低的水平，以防止细胞内铜的积累。考虑到目前对“铁死亡”的研究以及今天要描述的铜依赖性细胞死亡机制，是否意味着人体所含的50多种微量元素可能具有类似的诱导细胞死亡的机制？这还有待进一步探索。
今天我们来了解一下2022年3月17日的这篇文章，是由麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所的Peter和Todd R. Golub团队发表的，文章标题是：TCA循环导致的细胞死亡。
【概括】
铜是所有生物体必需的辅助因子，但如果浓度超过进化保守的稳态机制维持的阈值，就会产生毒性。然而，过量的铜如何诱导细胞死亡尚不清楚。在这里，我们在人类细胞中表明，铜依赖性的受控细胞死亡不同于已知的死亡机制，并且依赖于线粒体呼吸。我们表明，铜依赖性死亡是通过铜与三羧酸 (TCA) 循环的脂酰化成分直接结合而发生的。这会导致脂酰化蛋白质聚集并随后导致铁硫簇蛋白丢失，从而导致蛋白毒性应激并最终导致细胞死亡。这些发现可以解释对古老铜稳态机制的需求。
【流程图】
【主要结果】
所有生物体普遍需要铜作为必需酶的辅助因子。在人类中，铜可以与酶结合，帮助血液凝结，促进激素成熟和细胞能量加工。此外，铜参与许多生物行为。为了防止铜离子超载引起的细胞毒性和器官损伤，机体的主动稳态机制控制细胞内铜离子浓度稳定在极低水平。据报道，其他必需金属（如铁和锌）的毒性机制已经建立，但铜介导的细胞毒性作用和分子调控机制仍不清楚。
铜离子载体诱导的细胞死亡与传统的死亡途径不同
为了更好地研究铜对细胞的毒性作用，采用铜离子载体作为铜转运小分子工具。铜离子载体可以与铜结合，在细胞间穿梭。多重证据表明，铜离子载体诱导细胞死亡的机制涉及细胞内铜的积累，而非小分子伴侣本身的作用。首先，对1448种载铜药物对489种细胞的杀伤效果进行了测试，结果显示效果显著，但结构功能关系实验表明，消除与铜结合的多结构小分子的修饰会抑制其细胞杀伤能力。同样，铜螯合也会消除化合物的细胞毒性。
随后作者以强效铜离子载体为研究对象，研究了铜离子介导的细胞死亡机制。结果表明，单纯的引入对细胞生长没有明显的影响，而其他金属，如铁、钴、锌、镍等的加入，对细胞生长都没有影响。只有当铜离子加入并在细胞中积累时，细胞生长效果才会受到明显抑制。接下来作者用丁硫氨酸亚砜（BSO，会消耗细胞内的铜螯合剂谷胱甘肽）和四硫钼酸盐（TTM，一种铜螯合剂）分别处理细胞。结果表明，铜离子载体诱导的细胞死亡主要依赖于细胞内铜的积累。
此后人们证实，铜离子载体诱导的细胞死亡是一种新的细胞死亡途径，与传统的死亡模式（细胞凋亡、铁死亡、坏死）有显著区别。
与细胞呼吸有关的铜离子载体
研究观察到的一个现象是，当细胞依赖线粒体呼吸时，它们对铜离子载体的敏感性是依赖糖酵解的细胞的近1000倍。与诱导铁死亡的GPX4抑制剂ML162的敏感性相比，药物干预线粒体功能对细胞对铜离子载体敏感性的影响极其明显。有趣的是，线粒体解偶联剂FCCP对铜毒性没有影响，说明铜诱导的细胞死亡需要线粒体呼吸而不是三磷酸腺苷（ATP）的产生。在缺氧条件下培养的细胞中，铜诱导的细胞死亡减弱，说明铜死亡需要线粒体呼吸的参与，但糖酵解产生的ATP对铜诱导的细胞死亡影响不大。 （插入句子：考虑到肿瘤细胞增殖主要依赖于糖酵解途径，这是否意味着肿瘤细胞对铜死亡的耐受性更强？）
此外，作者发现，用铜离子载体治疗并没有显著降低基础或ATP相关的呼吸，但确实显著降低了呼吸储备能力，这表明铜并不直接参与电子传递链（ETC），而只是针对TCA循环的成分。为了证实这一点，对脉冲处理细胞的代谢物进行了分析，结果显示TCA循环相关代谢物在铜敏感细胞中显著增加。这些结果表明铜诱导的细胞死亡与线粒体代谢密切相关，进一步明确了铜与TCA循环之间的精确关系。
FDX1 是铜离子载体诱导细胞死亡的关键基因
为了确定介导铜毒性的特定代谢途径，作者进行了全基因组 Cas9 功能丧失筛选，并最终确定了铜诱导死亡的关键基因——铁氧还蛋白 1 (FDX1)。FDX1 编码一种可直接靶向的蛋白质，已知该蛋白质可将 Cu2+ 还原为毒性更大的形式 Cu1+。当 FDX1 基因被敲除时，它可以使细胞对铜诱导的细胞死亡具有更大的抵抗力。此外，当细胞在糖酵解条件下生长时，其中的大部分铜离子载体都会失去杀伤活性。这进一步说明了 FDX1 与铜和线粒体代谢之间的密切关系。
FDX1 是蛋白质脂肪酰化的上游调节剂
蛋白质脂酰化是赖氨酸的一种高度保守的翻译后修饰，已知只发生在四种酶上，这四种酶均参与调控TCA循环碳入点的代谢复合物，这些蛋白质的脂酰化是酶功能发挥所必需的。通过敲除FDX1或脂酰化相关酶，细胞可从铜毒性中拯救出来，这提示FDX1是否可能是蛋白质脂酰化的上游调控因子。为了验证这一假设，作者首先搜索公开数据库，发现FDX1和硫辛酸代谢与细胞存活高度相关。随后对208例人类肿瘤标本进行FDX1和硫辛酸的免疫组化染色，半定量分析也验证了FDX1与脂酰化蛋白的表达高度相关，且FDX1基因敲除导致蛋白质脂酰化的完全丧失和细胞呼吸作用的显著下降。 最终证实FDX1是蛋白质脂肪酰化的上游调节剂。
铜直接结合并诱导酰化 DLAT 的低聚化
至此，铜毒性与蛋白质酰化之间的联系已基本确立，但两者的直接机制作用仍不确定。当观察到铜与游离硫辛酸结合，且测得的解离常数达到 10-17 时，作者证实了铜可能直接与酰化蛋白质结合的可能性。为了进一步验证这一假设，从细胞裂解物中纯化了 DLAT 和 DLST，发现这些蛋白质与含铜树脂结合，但不与钴或镍树脂结合。当 FDX1 缺乏消除蛋白质酰化时，DLAT 和 DLST 不再与铜结合，这表明硫代酰基部分是铜结合所必需的。
此外，还研究了铜与酰化蛋白结合的影响，因为蛋白质耗竭挽救了铜离子载体治疗。研究了铜与酰化 TCA 循环蛋白结合是否会导致毒性功能获得。结果表明，铜与酰化 TCA 循环蛋白结合导致 DLAT 酰化依赖性寡聚化。免疫荧光证实，短脉冲治疗显著诱导了 DLAT 灶，而在 FDX1 敲除和酰化缺陷细胞中，DLAT 灶减少。这些发现支持了铜使含 Fe-S 蛋白质不稳定的模型。
【结论】
这项研究最终证明了铜诱导的细胞死亡是由一种古老的机制介导的：蛋白质酰化，而这些蛋白质大多集中在TCA循环中的酶促反应中。这项研究解释了线粒体代谢与铜介导的细胞死亡敏感性之间的关系：具有主动呼吸和TCA循环的细胞，酰化TCA酶（特别是PDH复合物）的水平增加，酰化部分作为直接的铜结合剂，导致酰化蛋白质聚集，含有Fe-S簇的蛋白质丢失，并诱导HSP70，反映了急性蛋白毒性应激。铜稳态的遗传变异可能导致危及生命的疾病。铜离子载体和铜螯合剂都被认为是抗癌剂。然而，铜超载导致细胞死亡，其机制仍不清楚。但在这项研究中，作者证明了铜毒性的机制不同于所有其他已知的调节细胞死亡的机制。因此，这种细胞死亡模式被命名为-（铜死亡）。
【启示】
1.“铁死亡”相关特征基因≈“铜死亡”相关
2. 根据相关特征进行分子分型
3.相关RNA（miRNA、mRNA）
4. 基因数据库的构建
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弗雷塞斯
-2015年浙江大学硕士、博士点成立
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