天津大学王泽方教授团队《Nat. Commun.》：工程化酵母全细胞催化系统实现高结晶PET塑料高效降解
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种广泛应用于服装、包装、医药等领域的塑料。然而由于其极强的化学和物理稳定性，PET制品在自然界至少需要数百年的时间才能自发降解，对全球生态安全和人类健康构成巨大威胁。近日，天津大学生命科学学院王泽芳教授团队设计构建了一种工程化酵母全细胞生物催化剂，将降解模块和疏水蛋白HFBI作为吸附模块展示在酵母细胞表面，创新性地实现了吸附和降解两个步骤在酵母细胞表面的有机统一。相关工作于2022年11月21日以“Poly( ) Cell of and ”为题发表在期刊上。该研究是课题组近两年来在生态安全领域取得的又一重要进展（PNAS, 2021, ； PNAS, 2021, ； , 2022, ）。
废弃的PET该如何回收利用？传统的物理、化学方法在工业生产中被广泛采用。近年来，“吃PET”酶的研究为PET降解开辟了一条绿色道路，它既能将PET分解为可重复利用的工业原料，又兼具传统物理过程简单、化学方法闭环降解的优点。然而，虽然利用“吃PET”酶催化降解低结晶度PET取得了长足进展，部分催化酶的应用甚至达到半工业化水平，但对于高结晶度PET（用于制作可乐瓶、矿泉水瓶等食品级容器），一直是这些降解酶“消化系统”的短板，降解能力十分有限。 天津大学生命科学学院王泽芳教授团队通过在酵母细胞表面共显示吸附模块HFBI与降解模块，构建全细胞催化体系，解决现有“消化系统”的不足，充分发挥降解酶“消化系统”在疏水PET界面对高结晶度PET的消化功能，实现hcPET的高效降解。
1. 酵母全细胞生物催化体系的构建
王泽芳教授团队构建的酵母全细胞催化体系，将疏水蛋白HFBI和PET水解酶同时展示在酵母细胞表面，模拟PET降解的两步过程，即吸附和水解，弥补了现有研究将二者割裂开来、主要关注水解步骤的局限性。在具体实验中，研究人员通过表面共展示技术，将人工设计的吸附模块疏水蛋白HFBI和降解模块固定到毕赤酵母细胞表面，并通过优化实现二者在酵母细胞表面的最佳组合（图1）。
图1. 酵母全细胞生物催化体系。(a)吸附模块疏水蛋白HFBI与降解模块结构图；(b)共展示体系示意图；(c)HFBI分子动力学模拟及100ns表面共展示技术固定在毕赤酵母细胞表面示意图；(d)不同诱导时间展示在酵母细胞表面的HFBI及免疫荧光图像。
2. 疏水蛋白HFBI通过增加酵母细胞表面的疏水性来增加共展示细胞在PET表面的吸附
在通过印迹和荧光共聚焦成像技术验证吸附模块疏水蛋白HFBI与降解模块成功展示在酵母细胞表面后，作者首先通过微生物粘附于碳氢化合物（MATH）实验（图2a-2c）证明展示在酵母细胞表面的HFBI是导致酵母细胞表面疏水性增加的原因；随后，利用接触角（WCA）实验（图2d-2e）进一步证明HFBI确实可以增加共展示细胞表面的疏水性； 最后，为了确认HFBI展示在细胞表面对细胞表面疏水性的影响是否可以转化为对酵母细胞在PET表面附着的影响，作者观察了不同条件下共展示细胞在hcPET表面的吸附情况，发现共展示细胞几乎覆盖了hcPET的全部表面面积，而相同条件下单展示的对照样品在hcPET表面的吸附急剧降低（图2f）。当同样的细胞在低浓度下进行结合测定时，也发现了类似的吸附差异（图2g）。这些结果均表明吸附单元HFBI通过增加酵母细胞表面的疏水性来增加共展示细胞在PET表面的吸附。
图2. 共显示细胞表面疏水性检测。(a)MATH实验示意图；(bc)诱导不同时间的共显示细胞MATH实验结果；(de)接触角实验测量结果；(fg)不同条件下共显示细胞与对照样品在hcPET表面的吸附情况。
3. 酵母全细胞生物催化体系具有高效的降解活性
随后作者将构建的酵母全细胞生物催化体系用于PET塑料降解。首先，探索共展示细胞水解hcPET的最佳条件，并与纯化的hcPET进行比较。结果表明，温度、pH值和蛋白质浓度（图3a-c）均对共展示细胞的转化率有显著影响，且在各测试条件下，共展示细胞的酶活性均高于野生型。最终的活性测试结果显示，全细胞生物催化剂对hcPET（结晶度为45%）的转化率比野生型高出约328.8倍（图3d）。然后，作者利用扫描电子显微镜和光学显微镜观察了经共展示细胞处理的hcPET的形态变化，以处理后的hcPET作为对照。 如图3e所示，经处理后的hcPET表面几乎没有出现表面侵蚀，而共显示细胞处理后的hcPET表面出现了明显的裂纹和侵蚀现象。同时，全细胞催化体系也表现出了较高的稳定性，在10天的长期反应条件下，与野生型hcPET转化率0.003%相比，全细胞催化剂将hcPET转化率提升至约10.9%（图3f）。以上结果表明，作者构建的酵母全细胞生物催化体系能够稳定高效地降解hcPET。
图3. 酵母全细胞生物催化体系可高效降解hcPET。(a)温度；(b)pH；(c)蛋白质浓度对PET水解的影响；(d)最佳反应条件下共显示细胞与野生型以PET为底物的转化率；(e)商用hcPET薄膜与共显示细胞孵育前后的SEM图像；(f)最佳反应条件下共显示细胞、单显示细胞和野生型降解hcPET的相对降解率。
4. 酵母全细胞生物催化体系稳定
为了测试共显示细胞是否可用于工业规模的全细胞生物催化剂，作者评估了与共显示细胞工业应用相关的几个性质，包括热稳定性、可重复使用性、化学或溶剂稳定性以及储存条件。从图4a可以看出，共显示细胞在30°C孵育7天后相对转化率仍保持在100％，表明在此孵育期间酶活性几乎没有变化，经过7轮循环使用后仍能保持50％的酶活性（图4b）。图4c显示当共显示细胞在0.1％X-100、10％甲醇和10％乙醇中培养时，它们仍然保持较高的酶活性。冻干是一种脱水过程，有利于共显示细胞的储存和运输。 从图4d可以看出，共展示细胞在冷冻干燥后对PET的转化率仍然接近100%，说明全细胞生物催化剂在脱水后几乎保留了所有的酶活性。综上所述，构建的酵母全细胞生物催化体系对于降解hcPET是稳定的。
图4. 酵母全细胞生物催化体系降解hcPET具有稳定性。(a)热稳定性；(b)可回收性；(c)化学试剂对共展示体系的影响；(d)冷冻干燥对共展示体系的影响。
5. 酵母全细胞生物催化体系降解hcPET的分子机制
随后，作者对全细胞生物催化体系降解hcPET进行了分子动力学模拟，提出了共展示体系分两步降解hcPET的分子机理。首先，由于吸附模块HFBI的存在，共展示细胞迅速吸附到hcPET表面，在hcPET上的吸附率接近100%。随后，降解模块接触高结晶度PET表面，以顺式构象水解PET链，从而实现高结晶度PET的高效水解（图5）。这表明黏附模块的引入是本体系高效降解hcPET的关键。
图5.hcPET水解全细胞催化体系示意图。
该研究提供了高效生物降解hcPET的策略，展示了表面展示体系的可塑性，通过在表面展示体系中引入不同的功能模块，可大幅提升其性能，对开发其他高性能协同表面展示体系具有重要的参考意义。
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