氯化钙除磷 目的基因PCR扩增产物的克隆
聚合酶链式反应（PCR）
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外酶促合成特定DNA片段的方法，是最常用的分子生物学技术之一。典型的PCR包括三个步骤：（1）模板高温变性；（2）引物与模板的退火；（3）引物沿模板的延伸。经过多个循环的反应，目的DNA能被快速扩增。其主要步骤为：将待扩增的模板DNA置于高温下（通常为93℃-94℃）使其变性为单链；两条人工合成的寡核苷酸引物在其适当的复性温度下与目的基因两侧的两条单链互补，两条引物在模板上的位置决定了扩增片段的长度； 耐热DNA聚合酶（Taq酶）在72℃时从引物的3'端开始掺入单核苷酸，以目的基因为模板，从5'→3'延伸，合成新的互补DNA链。
PCR能快速特异地扩增任何已知的目标基因或DNA片段，可以很容易地将皮克（pg）级别的起始DNA混合物中的目标基因扩增到纳克、微克或毫克级别的特定DNA片段。因此，PCR技术一经推出，便在分子生物学的各个领域得到迅速而广泛的应用。它不仅可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，而且可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等许多方面。通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有以下多种用途：（1）生成双链DNA中的特定序列作为探针；（2）由少量mRNA生成cDNA文库；（3）从cDNA中克隆某些基因；（4）生成大量DNA以供序列测定；（5）突变的分析； （6）染色体步行； （7）DNA 多态性分析，如 RAPD、AFLP、RFLP 等 一、试剂准备 1. DNA 模板 2. 与目的基因对应的特异性引物 3. 10×PCR 4. 2mM：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM 5. Taq 酶 二、操作步骤 1. 冰浴下，按以下顺序将各组分加入到无菌 0.5ml 离心管中 10×PCR 5 μl dNTP mix（2mM） 4 μl 1（10pM） 2 μl 2（10pM） 2 μl
Taq 酶（2U/μl） 1μl DNA 模板（50ng-1μg/μl） 1μl 加 ddH2O 至 50μl 视 PCR 仪是否带加热盖而定加入或不加入石蜡油。 2.调整反应程序。将以上混合液离心后立即置于 PCR 仪上进行扩增。一般：93℃预变性 3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s→58℃ 30s→72℃ 60s，循环30-35 次，最后72℃保温7min。 3.结束反应，将 PCR 产物放置 4℃电泳检测或-20℃长期保存。 4、PCR的电泳检测：若反应管中加入石蜡油，需用100μl氯仿抽提反应混合物以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl进行电泳检测。3、PCR反应体系组成及反应条件优化PCR反应体系由反应缓冲液（10×PCR）、脱氧核苷三磷酸底物（）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡核苷酸引物（、）、靶序列（DNA模板）五部分组成。其中每一个组分都可影响PCR结果的质量。1、反应缓冲液：一般随Taq DNA聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl、10mM Tris-HCl（pH8.3室温）、1.5mM MgCl2。
Mg2+的浓度对反应的特异性和产量有显著的影响，浓度过高，反应的特异性会降低；浓度过低，产物会减少。各种单核苷酸浓度为200μM时，1.5mM的Mg2+较为适宜。若样品中含有EDTA或其他螯合物，可适当提高Mg2+的浓度。在高浓度的DNA和dNTP下反应时，Mg2+的浓度也必须作相应调整，根据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）为佳。2、dNTP：高浓度的dNTP容易发生错误掺入，浓度过高可能扩增不出来；但浓度过低又会降低反应产物的产量。PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。 四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，其中任何一种浓度与其它有明显差异（过高或过低）都会诱发聚合酶的错误掺入，降低合成速率，过早终止延伸反应。另外，dNTP能与Mg2+结合，降低游离Mg2+浓度，因此dNTP浓度直接影响Mg2+浓度，而Mg2+在反应中起着重要作用。 3、Taq DNA聚合酶：在100μl反应体系中，一般加入2-4U酶，即可达到每分钟1000-4000个核苷酸的掺入速度。酶加入过多会导致非特异性产物的产生，但不同公司或不同批次的产品往往差别很大。由于酶浓度对PCR反应影响很大，应进行预先试验或采用厂家建议的浓度。
当减少反应体积（如20μl或50μl）时，酶用量一般不低于2U，否则会降低反应效率。 4、引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极其重要。为保证PCR反应能准确、特异、有效地扩增模板DNA，引物设计通常应遵循以下原则： （1）引物长度应为15-30bp，一般（G+C）含量为45-55%，Tm值高于55℃[Tm=4(G+C)+2(A+T)]。应尽量避免几个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应呈现随机性。 （2）引物的3’端不要与引物内部互补，避免引物内部形成二级结构。 两条引物在3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。3’端的最后一个碱基大大影响Taq酶的延伸效率。两条引物之间配对的碱基数应少于5个，如果引物本身配对形成茎环结构，则茎的碱基对数不能超过3个。由于影响引物设计的因素较多，常采用计算机辅助设计。 3’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 4’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 5’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 6’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 7’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 8’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 9’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 10’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 11’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 12’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 13’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 14’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 15’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 16’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 17’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 18’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 19’端两条引物的3’端不应有同源性，避免形成引物二聚体。 20’
一般以0.25-0.5pM/μl为佳。⑸引物一般用TE配成较高浓度的母液（100μM左右）后保存于-20℃，使用前取一部分用ddH2O配成10μM或20μM工作液。5、模板：PCR对模板的要求不高，单链和双链DNA均可作为PCR样品。虽然PCR可以使用极少量的样本（甚至单个细胞的DNA）作为模板，但为了保证反应的特异性，一般建议以μg级别的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。 原料可以是粗品，有的材料甚至只经过一步溶剂提取即可用于扩增，但任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂及能与DNA结合的蛋白质都可能干扰PCR反应。 6.加快PCR循环，即相对减少变性、复性和延伸的时间，可增加产物的特异性。 四、注意事项 1.PCR反应应在洁净、无DNA污染的环境中进行，最好设立专门的PCR实验室。 2.纯化模板的方法对污染风险影响很大，一般来说，纯化方法越简单越好，只要能得到可靠的结果即可。 3.所有试剂应不含核酸和核酸酶污染。操作时应戴手套。 4. PCR 试剂应使用最高品质的新鲜双蒸水制备，并用 0.22μm 过滤器过滤和灭菌或高压灭菌。5. 试剂应大量制备，测试是否满意，然后分装成仅供一次使用的量并保存以确保实验之间的连续性。6. 试剂或样品制备期间应使用一次性灭菌塑料瓶和管，玻璃器皿应清洗并高压灭菌。7. PCR 样品应在冰浴中解冻并充分混合。
目的基因PCR扩增产物的克隆
【实验原理】
1. PCR 产物回收
在高离子盐存在下，DNA片段在离心柱中被选择性地吸附在硅基质膜上，然后通过一系列快速冲洗和离心步骤去除蛋白溶液和漂白液，去除引物、核苷酸、蛋白酶等杂质。最后用低盐、高pH的洗脱缓冲液从硅基质膜上洗脱出纯净的DNA。
2. T载体与PCR产物的连接
源DNA与载体分子之间的连接即为DNA重组，重组后的DNA称为重组体或重组子。重组DNA分子在含有Mg2+和ATP的连接缓冲体系中，在DNA连接酶的作用下，经酶切分别与载体分子和外源DNA分子连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶均具有连接两个具有相同粘性末端的DNA分子的功能，而T4噬菌体DNA连接酶具有大肠杆菌DNA连接酶所不具备的特性，即能连接两个具有平端的双链DNA分子。但这种连接的效率比粘性末端的连接率要低。一般可通过增加T4噬菌体DNA连接酶的浓度或增加DNA浓度来提高平端的连接效率。 T4噬菌体DNA连接酶催化的DNA连接反应分为三步：首先T4 DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后酶-ATP复合物以5′磷酸基团和3′羟基切口与DNA结合，使DNA腺苷酸化；最后生成新的磷酸二酯键封闭切口。连接反应通常将两个大小不同的片段连接起来。由于DNA片段有两个末端，因此切割时有两种可能，一种是单酶切割，一种是双酶切割。两种酶切割方法在基因工程操作中都经常使用。对于单酶切割，载体和供体的末端相同，可以在任意末端之间进行连接，从而产生大量的自连接产物。为了降低自连接成环的高背景，可以对载体进行5′去磷酸化处理。 其原理是连接酶只能连接DNA片段的3’OH端和5’端，因此载体去磷酸化后不会自环化。一旦有外源片段插入，外源片段提供的5’端就可以连接到载体上。这种方法可以大大降低载体自环化造成的高背景。对于双酶切来说，载体和供体的同一片段有不同的末端，这样就避免了载体和供体的自环化，可以大大增加有效的连接产物。双酶切的另一个特点是可以定向地将供体分子连接到载体上。
连接反应温度在37℃有利于连接酶的活性发挥，但在此温度下粘端氢键不稳定，因此采用折衷温度12-16℃、12-16h（过夜），既能最大限度发挥连接酶的活性，又能兼顾瞬时配对结构的稳定性。Taq DNA酶扩增的PCR产物在DNA双链的前后两端各有一个游离的A碱基，可以与T端游离的T碱基互补，形成环状重组T质粒。
【实验材料、试剂与仪器】
PCR扩增相关试剂、PCR仪、移液器、低温离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、PCR产物回收试剂盒、pUCm-T载体。
[实验步骤]
1. PCR 扩增
PCR反应体系：
注：每组5管，其中4管用于PCR产物回收，1管作为电泳检测对照。
PCR反应步骤：
2. 琼脂糖电泳检测目的基因PCR扩增产物
(1) 琼脂糖凝胶的制备
称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入20ml 1.0×TBE缓冲液，在微波炉或水浴中加热至完全溶解，取出，摇匀，即得1%琼脂糖凝胶溶液。
（2）取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用胶带将有机玻璃内槽两端边缘密封（一定要密封严实，不留缝隙）。
（3）将内层有机玻璃槽置于水平位置，放上样品梳。
（4）把冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶溶液慢慢倒入有机玻璃内槽中，直至有机玻璃板上形成一层均匀的凝胶（注意不要产生气泡）。
（5）待凝胶凝固后，取出梳子，去掉胶带，放入电泳槽中。
（6）向电泳槽中加入电泳缓冲液。
（7）用移液器将DNA样本加入到加样缓冲液中（记录加样顺序和量）。
（8）打开电泳槽及电泳仪电源（注意正负极，DNA片段由负极向正极移动）。DNA迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当溴酚蓝染料移至距凝胶前端1~2cm处时，停止电泳。
3. 产品回收
（1）在紫外光照射下从琼脂糖凝胶上切下目标片段，置于1.5 mL离心管中，加入500 μl溶胶/结合溶液DB，充分混匀。
（2）将上步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱置于收集管中），室温下放置1分钟，离心30-60秒，弃去收集管中废液。
（3）加入700μl洗涤缓冲液（WB），离心1分钟，弃去废液。
（4）加入500μl洗涤缓冲液（WB），离心1分钟，弃去废液。
（5）将吸附柱AC放回空收集管中，离心2 min，尽可能去除冲洗液，避免冲洗液中残留乙醇抑制下游反应。
（6）取出吸附柱AC，放入干净的离心管中，在吸附膜中部加入50 μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液需事先在65-70℃水浴中加热，效果更佳），室温放置2分钟，离心1分钟，如果需要更大量的DNA，可将所得溶液倒回离心吸附柱中，离心1分钟。
4. PCR 产物与 T 载体的连接
常规DNA连接请参考如下连接反应体系，或按照DNA说明书操作，每个连接反应使用1μl pMD 18-T载体和约0.2pmol PCR产物，10μl连接体系中4℃反应过夜或室温反应1h。
T4 DNA（2X）5μl
PCR 1μl
pMD 18-T 1μl
T4 DNA（5-10U/μl）1μl
ddH2O 最多 10μl
5. 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
①挑取E. coli.DH5α新鲜单菌落接种于含10ml LB液体培养基（不含抗生素）的试管中，37℃恒温摇床（）培养约4小时（OD=0.2~0.4），取出后立即放入冰浴中浸泡10分钟。
②无菌条件下，吸取1 ml冰浴后的菌液于冰预冷的1.5 ml无菌离心管中，4℃离心1 min，回收菌体。
③ 每管加入500 μl预冷的4℃CaCl2重悬沉淀，冰上放置30分钟，4℃离心1分钟，回收菌体沉淀。
④ 每管加入200 μl冰冷的CaCl2，混匀，获得感受态细胞，放入4℃冰箱备用。
6. 重组质粒转化大肠杆菌
① 取10 μl连接产物加入到含有100 μl感受态细胞的离心管中，轻拍管壁混匀，冰上放置30分钟。
② 42℃热激90s后，迅速将离心管放入冰浴中3-5min。
③ 加入1 ml不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37 °C振荡培养（180 rpm）45分钟。
④ 4℃，10,000g 离心 1 分钟，取 500 μl 上清弃去，混匀，取 200 μl 点于含 100 μg/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基平板上（预加 4 μl 200mg/mg IPTG 和 20 μl 40mg/ml X-gal），待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，37℃培养 12-16 小时，直至出现单个菌落，再将培养皿置于 4℃培养，待其充分显色（即出现蓝白色斑点）。
⑤连接产物进行转化实验时，用等体积的ddH2O代替连接产物，操作同上，分别涂布于含抗生素和不含抗生素的LB平板上，作为阴性对照和阳性对照。
7. 重组克隆的鉴定（此部分取决于实验的进展）
挑取可能含有目的片段的白色斑点，接种于5 ml LB/Amp液体培养基中，37℃220 rpm振荡培养箱中培养过夜。用碱裂解法从菌液中提取少量质粒DNA，进行PCR扩增，检测PCR产物是否与载体连接。
附录：TBE电泳缓冲液的配制
5×TBE（5倍体积的TBE原液）
使用 5×TBE：
三羟甲基氨基甲烷 54克
硼酸 27.5g
0.5mol/l EDTA 20毫升（pH 8.0）