科研显微图像的共定位分析讲座Q & A（Part 2）
2020年6月4日，受细胞生物平台邀请的高级应用工程师高莹莹做题为《科研显微图像共定位分析》的讲座，主要介绍了共定位相关的数字图像概念、图像共定位分析、图像共定位分析的应用等内容。讲座现场气氛活跃，师生在线互动活跃，积极讨论交流。我们整理了一些精彩的问答环节，供大家学习交流。
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问：您如何呈现共定位统计数据？您需要在论文中包含共定位分析结果吗？
A：在多通道荧光图像中，每个像素包含至少两个荧光信号（Ch1，Ch2）的灰度值。共定位2D散点图的X/Y轴对应共定位分析中的一个荧光。通道，将每个像素对应的Ch1、Ch2的灰阶值分别取为(x,y)值，并定位在坐标轴上，因此两个通道的像素灰阶值的相关性趋势从散点图中可以直观的看出。二维散点图可以像普通图像一样保存和显示。少数共定位分析的论文会直接展示二维散点图，但图像共定位的分析结果一定会展示。最常用的是皮尔逊相关系数Rr('s nt)和曼德尔重叠系数R(')。
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Q：制作共定位散点图时，对两个通道的灰度值做什么样的数学处理来作为散点图的特征？
因为图像是二维矩阵，但是散点图中的x，y都是一维矩阵。
答：二维散点图中的XY坐标代表共定位分析两个通道的灰度值。散点图上的每个点代表原始图像中的一个像素。像素的位置由两个通道的灰度值。灰度值决定了信号。因此，在共定位二维散点图中，象限B代表两个通道灰度值都较强的信号。
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问：在 Slice 视图中，xy 和 xz 不相关，但 yz 相关，那么这是共定位吗？
A：切片视图可以同时显示XY/XZ/YZ图像，模拟从上/前/左方向看到的立方体。使用此工具可以初步确定信号重叠。如果两个通道信号重叠，则无论从无论从哪个角度看，都应该有重叠。
此图中，YZ方向信号重叠，但XZ/YZ方向错位，信号不重叠。你可以想象将手掌放在一起，从左/右侧观察手掌的重叠情况。事实上，从上方和正面观察时，手掌平行，但从左右两侧观察时，手掌重叠。
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Q：如何在文章中更清晰的呈现共定位图像？是否应该圈出我们想要展示的部分，然后用另一张图片放大，或者有没有更好的软件来提高整个图像的清晰度？
A：由图像中共定位信号的面积/信号强度决定。如果共定位信号是小颗粒信号，可以采用局部缩放，既能显示整体图像，又能显示细节。
图像清晰度与图像分辨率和光学分辨率都有关系，采集图像时需要选择合适的图像分辨率，如1024*1024，并选择高光学分辨率成像，才能获得高质量的原始图像。信号接收后，放大后的图像马赛克现象严重，可以考虑重新分割像素大小，比如原图分辨率512*512，实际图像大小，像素大小为0Q:3um/pixel，经过200%，就变成了图像分辨率1024*1024，实际图像大小不变，像素大小为0Q:15um/pixel。但是这种方式并没有提高光学分辨率，也没有增加图像细节，只是降低了像素大小，削弱马赛克视觉效果。
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问：我们可以计算同一细胞内共定位的两个通道蛋白的比例吗？
答：可以。你可以将共定位和计数测量结合起来。共定位生成的共定位层用于计数数量或面积，然后与原始图像计算比例。你也可以只使用通道 1 中的计数测量工具. 识别并统计通道2的信号数目/面积/强度，并计算共定位率。这可以在大多数制造商的软件中实现。
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问：点扩散函数是在xy方向还是xz方向？能详细解释一下吗？
答：PSF（点扩散函数）是点状物体通过成像系统形成的散射光斑。光斑扩散的质量和形状可以作为光学系统质量的衡量标准。PSF 是一个三维 XYZ 扩散信号。
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问：使用共聚焦显微镜进行共定位分析时，反卷积是否必要？
A：建议进行反卷积处理（）。共聚焦显微镜可以阻挡非焦点信号，获得清晰的当前焦点信号，但PSF对共聚焦显微镜的影响仍然存在。利用针孔尺寸等参数，可以计算出理论上的PSF进行计算并用于反卷积计算。这种反卷积称为盲算法，比使用珠子测量PSF的非盲方法相对简单和高效。反卷积是目前最有效，使用相对简单的反卷积处理方法。
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问：反卷积是在分析图像时进行还是在获取图像时进行？
A：建议后期进行反卷积处理，采集时保留原始图像格式，防止采集时反卷积和背景去除参数或算法不合适导致有效信号丢失，至少会误导分析，甚至导致最坏的情况是怀疑数据造假。在进行反卷积时，建议对复制的图像进行操作，以避免覆盖原始数据。
细胞生物学平台介绍
清华大学生物医学测试中心细胞生物学平台致力于科研服务，是清华大学-北京大学生命科学联合中心的依托机构，为清华大学生命、医学、化学、化工、环境、材料、航空航天等相关学科。为科研和人才培养提供技术支持和测试服务。主要提供细胞生物成像与分析测试服务。目前平台拥有光学显微镜单元和电子显微镜单元。
光学显微镜仪器
受激发射损耗超高分辨率共聚焦显微镜
（）
蔡司倒置激光共聚焦显微镜
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倒置激光共聚焦显微镜
（）
全自动数字幻灯片扫描系统
.Z1()
全自动数字幻灯片扫描系统
能（）
全自动活细胞显微镜系统
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荧光光镊系统
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高配置数据处理工作站及专业分析软件
电子显微镜仪器
透射电子显微镜 日立
H-7650B（）
透射电子显微镜
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超薄切片机
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冷冻超薄切片机
（）
高端数据处理软件，满足用户电子显微镜数据分析需求，并提供样品制备及切片服务