光生物催化，Nature Chemistry！

通讯单位：匹兹堡大学、加州大学圣巴巴拉分校

DOI: 10.1038/-024-01494-0（点击文章末尾的“阅读原文”链接）

背景

天然存在的光酶是一类迷人的酶，需要稳定的光输入才能进行催化。尽管进化在很大程度上选择了不进行光酶催化，但光酶中的能量中间体为发现不寻常的光物理和光化学以及通过激发态生物催化进行的新型光酶反应提供了丰富的研究领域。最近发现的藻类衍生脂肪酸光脱羧酶 (FAP) 凸显了它们与之前研究的天然光酶（包括原叶绿素氧化还原酶和 DNA 光酶）相比的合成潜力。这些黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 依赖性光酶可以通过自由基机制有效地对丰富和/或易得的羧酸进行光脱羧。之前对 FAP 的大量研究工作集中在扩大其天然原脱羧活性的底物范围。然而，迄今为止，黄素依赖性 FAP 的新型天然活性仍然难以捉摸。尽管天然光酶具有令人着迷的光物理和光化学活性，但它们尚未被重新用于新颖的天然反应。

研究问题

本研究设计了脂肪酸光脱羧酶，以强氧化激发态黄酮醌辅因子为原料，催化非天然光氧化还原自由基CC键的形成。通过基因组挖掘、合理设计和定向进化，开发了一系列自由基光环化酶，以优异的化学、对映体和立体选择性促进脱羧自由基环化。本研究中的高通量实验工作流程实现了脂肪酸光脱羧酶的定向进化。本研究设计了一组正交自由基光环化酶，以获得四种可能的立体化学二元体的立体异构体，从而在不对称自由基生物催化中实现完全立体和对映体特定的不对称自由基生物催化转化。分子动力学模拟表明，改进的自由基光环化酶可以轻松实现近角构象（near-），从而实现化学选择性的自由基环化。立体选择性自由基光环化酶的开发为天然光酶家族提供了非天然CC键形成活性，可用于控制自由基介导反应的立体化学。

图 1 | FAP 的重新利用和定向进化为新的天然立体选择性 RAP。

要点：

1. 本研究推断，如果可以设计天然 FAP 来拦截具有 C=C 双键的新生碳中心自由基，则可以开发新的天然自由基光环化酶 (RAP) 来促进立体控制的自由基环化反应（图 1）。在这些过程中，现成的羧酸被用作自由基前体，使整体氧化还原中性自由基环化反应得以发展，从而无需化学还原剂。在本研究设想的催化循环开始时（图 1a），可见光照射会产生光激发的强氧化性黄酮类 FADq*。单个电子从羧酸底物转移到 FADq*，然后快速脱羧产生烷基自由基和黄素糖苷酮 FAD--（FADsq）。在此阶段，这种亲核烷基自由基与悬垂的 α,β-不饱和羰基发生加成反应，生成新的碳中心自由基。随后，黄酮糖苷配基 FAD 与保守氨基酸残基之间的电子转移/质子转移 (ET/PT) 或质子偶联电子转移 (PCET) 会以立体控制的方式生成产物并再生 FAD 辅因子，从而完成催化循环。

图 2 | 化学选择性和立体选择性 RAP 的开发：FAP 的工程设计

要点：

1. 目标5-外三自由基环化根据规则在动力学上非常容易进行，因此最初的研究重点放在α,β-不饱和酯羧酸底物1a的对映选择性脱羧自由基环化上（图2）。除了在天然原羧化光酶反应中被广泛研究的CvFAP外，还建立了内部FAP同源物库，用于鉴定和开发有效的立体选择性RAP。本研究基于非冗余蛋白质序列数据库中的搜索，以CvFAP为模板，从葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶超家族中筛选出具有功能上必需保守的半胱氨酸和精氨酸残基（对应于CvFAP的C432和R451）的假定FAP，以提供初始的FAP同源物库。本研究发现的FAP与CvFAP的同源性为45%~73%，构成了结构多样的初筛文库，可用于开发非天然脱羧类光酶反应。图2a为部分筛选出的FAP同源物的系统发育树。

2. 本研究伊始曾设想，若能利用蛋白质支架将底物1a引导至自由基环化的近攻击构象，则可有效抑制光酶脱羧形成的碳中心自由基与光激发的FADq*发生不良的PCET过早终止。然而，野生型FAP在自然进化过程中以延伸的线性构象容纳疏水性长链脂肪酸。在野生型CvFAP与脂肪酸底物复合物的晶体结构中（图2b），构象灵活的脂肪酸底物被迫在CvFAP的疏水隧道中采用略微弯曲但本质上是延伸的结合模式。在这种结合构象下，羧酸自由基前体和α,β-不饱和自由基受体彼此距离较远，不利于本研究提出的自由基环化反应。

3. 为了克服这个问题，本研究设想，如果能用较小的残基替换较大的芳香残基，以进一步扩大底物结合口袋，羧酸烯烃底物将可以自由地采样可能的构象，从而促进所需的自由基环化。在研究野生型 CvFAP 的晶体结构时发现，位置 466 (Y466) 的酪氨酸残基在形成底物隧道中起着关键作用（图 2b）。用丙氨酸替换该酪氨酸将大大加宽 CvFAP 的活性位点，从而促进自由基环化。因此，本研究进行了定点诱变，以生成 CvFAP (Y466A) 和所有 FAP 同源物的类似酪氨酸-丙氨酸突变体，并测试了它们对 1a 的光生物催化自由基环化的活性（图 2a）。使用 FAP 变体的无细胞裂解物进行初步的光酶活性评估。

图3 | RAP催化不对称脱羧自由基环化反应的底物适用性

要点：

1. 在获得一组进化的RAPs后，接下来探索了该光酶自由基环化反应的底物适用性（图3）。除了乙酯2a，甲酯（2b）、正丙酯（2c）和2-溴乙酯（2d）也是光生物催化自由基环化反应的优良底物，它们生成的环化产物具有良好至优异的对映选择性。内酯2e也可以转化，且产率高，对映体可控。重要的是，α-卤素取代的α，β-不饱和酯也是良好的自由基受体，可以生成高度对映体富集的α-氟酯（2f）、α-氯酯（2g）和α-溴酯（2h）。因此，这些进化的RAPs提供了一种以催化不对称方式制备对映体富集的α-卤代酯的新方法。增加乙基（2i）的α-取代基的大小不会降低酶对自由基环化过程的对映体控制。除了α，β-不饱和酯，α，β-不饱和酰胺2j也转化为环化产物，尽管转化率和对映体选择性较低。α，β-不饱和酮（2k）顺利进行光酶转化，但环化产物以外消旋方式形成。

图4 | 正交光酶变体的定向进化，用于1p与-的立体异构不对称自由基环化。

要点：

1. 本研究进一步挑战了设计的RAP，以立体发散的方式在α和β位置设置两个连续的立体中心（图4）。为了形成具有高立体选择性的立体化学二元化合物，光环化酶必须对CC键形成的自由基环化步骤和随后的质子转移步骤有精确的控制。为此，选择1p作为模型底物，以提供具有相邻α和β立体中心的产物2p。从（）开始，又进行了三轮位点饱和诱变和筛选，最终得到（G431W/I130F/A131V）（），这进一步提高了（2S,3R）-2p形成的非对映选择性和对映选择性（产率83％，90:10 dr，>99:1 er）。

2. 此外，对 1p 光生物催化环化过程中进化的线进行评估，发现中间变体 (CvFAP(Y466A/G462A/S574A/S464A)) 和最终变体表现出相似的非对映体和对映体选择性，超过 ()。因此，对起始变体进行了进一步的定向进化。结果发现 (T465S) 通过反转 β 立体化学来逆转非对映体选择性，同时显著提高 (2S,3S)-2p 的对映体选择性（产率 72%，33:67 dr，98:2 er）。进一步的蛋白质工程产生了 (T465S/T131S) ()，其产率为 86%，20:80 dr，大于 99:1，得到 (2S,3S)-2p。

图 5 | 进化效用

要点：

1. 此外，在定向进化的驱动下，β-和α-立体化学均可逆转，通过酶促控制可获得2p的所有四种可能的立体异构体。具体来说，从一开始，通过迭代位点饱和诱变和筛选，(A466F/S465M/V463A) () 以 55% 的产率、dr 为 59:41、er 为 90:10 获得了具有逆转 α 立体化学的 (2R,3S)-2p（图 4）。此外，第四种立体异构体 (2R,3R)-2p 也可与另一种进化的 RAP（I130F/T484S/V463N) () 以 89% 的产率、dr 为 78:22、er 为 96:4 合成（图 4）。

2.本文报道的生物催化剂可控、完全非对映异构和对映异构体化获得所有四种可能的立体异构体，这是全酶不对称自由基生物催化领域的典范，凸显了天然FAP光酶的特殊可调性。此外，1a转化为2a，产率为86%，对映选择性为25:75（图5a）。它们共同构成了一组正交生物催化剂，可用于单立体中心环化产物的对映体合成。此外，利用四取代烯烃1q可以转化为具有季碳的高度对映体富集的产物2q（图5b）。

图6 | 酶活性位点自由基环化的MD模拟

要点：

1. 为了进一步理解CC键形成自由基环化相对于过早PCET的化学选择性大大提高，我们进行了经典分子动力学（MD）模拟以探索光酶催化1a脱羧形成的烷基自由基4a的构象空间（图6）。MD模拟结果表明，在野生型CvFAP的活性位点中，烷基自由基中间体4a倾向于反反构象，其自由基中心（C7）和β碳（C3）之间的距离较长（距离d = 4.8-5.3 Å；图6b，d）。相反，进化的RAP中烷基自由基4a的构象由于其活性位点比野生型CvFAP显著扩大而更加灵活。在最常见的高切反构象中，C3-C7距离约为4.1-4.7 Å（图6b，e）。

2. 加速MD增强采样模拟证实了4a在野生型CvFAP和进化型CvFAP活性位点构象的差异（图6c），表明野生型CvFAP偏爱反-反构象，且偏爱高-高-反构象。传统MD和加速MD模拟均表明近攻击构象（d(C3-C7) ≤ 3.1 Å）在野生型CvFAP（5.5 kcal mol-1）中很少出现，而在进化型CvFAP中出现相对较多（2.1%，1.5 kcal mol-1）。传统MD模拟代表性快照（图6d，e）表明在野生型CvFAP中，残基Y466和Q486阻挡了4a的C=C双键的两个π面，不利于自由基环化为C=C双键。因此，引入关键的 Y466A 突变会增加结合口袋的直径，从而使自由基中间体采用弯曲的近攻击构象，并消除阻止野生型 CvFAP 中自由基环化的空间屏蔽。

总结与展望

总之，本研究将天然 FAP 重新利用并进化为非天然 RAP，以通过开壳机制催化立体异构体环化。高通量实验平台的进步使 FAP 的定向进化成为可能，从而开发出一系列高度化学和立体选择性的 RAP。值得注意的是，成功进化出一组非对映体和对映体发散的 RAP 变体，从而可以制备立体化学二元化合物的四种可能的立体异构体。这些结果代表了重新利用天然光酶以实现新天然化学的努力。总之，FAP 的杂合性和特异进化性凸显了它们在解决自由基化学和不对称催化领域长期存在的挑战方面的巨大潜力。

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