水活性和有机溶剂对生物催化剂性能的影响

水活性和有机溶剂对生物催化剂性能的影响

文字| 昭英月明

编辑| 粤明照片

“ - [·前言·] - ”

酶固定化是扩大酶的应用范围、实现生物催化剂的回收利用、从而实现更绿色、更经济的过程的关键策略。 技术优势的充分利用与载体的优化选择和固定化方案的合理制定密切相关。 本研究通过固定在有机溶剂（甲苯）中的 ω-氨基转移酶的活性来实现这一目标，该酶固定在具有不同孔隙率和表面功能化的商业控制孔隙率玻璃载体（EziG™）上。

除了更传统的湿化学方法和共焦显微镜之外，还利用红外显微光谱和成像以无标记的方式突出酶的分布，并提供固定化酶相对于天然形式的构象细节，这与预期相反对于酶来说，在有机溶剂中获得的最高活性是在最亲水的固定方案下，对酶的二级结构影响更严重。

实验数据表明，反应体系中水分活度值在0.90以上对转氨酶反应效率有积极影响。 这项研究是基于直接观察固定化后酶构象合理开发固定化方案的第一个例子，揭示了不同工艺参数之间的关系以及载体特性之间的相互作用。

«——[·转氨酶的应用与研究·]——»

酶越来越多地用于进行一系列化学反应。 这些来自自然界的催化剂通常是可持续的、选择性的和高效的，并且可以提供各种好处，例如环境友好的制造工艺、减少溶剂、酶的使用、较低的能源需求、高原子效率和降低的成本、酶固定化允许连续加工、减少生产成本和废物流的产生，此外，防止蛋白质污染是工业使用固定化生物催化剂的进一步动机之一。 一。

转氨酶（TA），也称为氨基转移酶（EC 2.6.1），是利用辅酶吡啶醛-5'-磷酸（PLP）（PLP）催化氨基酸和α-酮酸之间的转氨反应的酶，PLP是维生素 B6 的活性形式。 它与活性位点赖氨酸的ε-氨基残基形成席夫碱。 氨基从氨基供体转移至 PLP，生成 5-磷酸吡哆胺 (PMP)。 ，当氨基供体作为相应的酮被释放时，氨基受体化合物与PMP反应形成相应的胺，从而自动再生PLP。

转氨酶接受的底物中氨基的位置决定了其分为α-TA和ω-TA。 α-TA 只允许形成 α-氨基酸，而 ω-TA 可以将氨基从底物转移至羧基和氨基之间的几个碳原子，因为它们可以胺化更广泛的底物，例如酮酸、醛，和酮，并且它们接受没有羧基的酮和胺。

数十年对非水介质中酶的研究表明，当需要疏水性底物或改变反应、产物和生物催化剂的热力学平衡时，在单相有机溶剂中使用生物催化剂可以提供显着的优势。 更容易回收是在生物转化中使用有机介质的另一个优势。

尽管ω-TA具有巨大的潜力，但与严重副产物抑制和替代产物形成的不利平衡相关的根本挑战阻碍了转氨酶的广泛应用。 在本研究中，我们研究了大肠杆菌中表达的 ω-TA -转氨酶变体 His6- ATA-117,13。 该变体的一些特征是其对高浓度共溶剂的耐受性以及对低成本胺供体（例如异丙胺）的接受。

用作酶固定化载体的材料的特性对于实现生物催化剂的工艺效率和可重复使用性至关重要。 除了化学和机械稳定性外，载体的疏水-亲水平衡及其孔隙率在决定材料的能力方面起着重要作用，不仅将酶结合到特定的表面积上，而且还吸附水，从而创造有利于酶活性的微环境。

此外，众所周知，水在载体和本体介质之间的分配会影响化学反应的热力学平衡，仔细控制水的分配和酶分子在载体上的分布将有助于优化生物催化剂的性能，科学文献中报道的描述 关于这些现象的直接可视化的研究数量非常有限。

«——[·转氨酶的固定化和脱水·]——»

omega-转氨酶变体 His6-ATA-11732 固定在三种不同的 EziG™ 载体上：EziG1 - 蛋白石亲水性、EziG2 - 珊瑚疏水性和 EziG3 - 琥珀半亲水性，一种含有 Fe3+ 的有机聚合物，Fe3+ 可以与金属离子结合选择性结合组氨酸标记的酶，因此直接从游离细胞提取物中进行固定，无需事先纯化酶。

使用多组氨酸亲和标签 (His6) 可以实现高效的纯化过程（在本例中为固定化，因为 EziG 技术可用作纯化和固定化技术），但也可能对酶活性和结构产生负面影响。

值得注意的是，ω-氨基酶表面存在多个疏水区域，它们与载体的相互作用预计取决于它们的疏水性或亲水性。 应该强调的是，该酶在大肠杆菌中表达，相反，它不含可能筛选水介质表面疏水区域的聚糖。 然而，当蛋白质暴露于不同的介质或与不同化学性质的载体相互作用时，酶表面的溶剂化甚至其构象特征可能会发生变化，就像三种不同的 EziG™ CPG 基质的情况一样。

事实上，为了防止生物催化剂的湿颗粒在疏水性有机介质中聚集，必须除去多余的水，并且在后一种情况下，用添加辅酶或蔗糖的四种不同缓冲溶液处理固定化的 His6-ATA-117 样品。 多元醇用于促进额外水的结合，从而保护蛋白质免于变性。

事实上，严格的脱水过程（100°C 干燥）会从酶的结构中去除必要的水分子，从而危及其活性。 固定化的 His6-ATA-117 样品还用 iPrOH 冲洗以除去多余的水。 ，然后使用甲苯去除残留的与水混溶的醇，这会对蛋白质稳定性产生不利影响，还可能干扰化学反应。 经过这些预处理后，不同配方的固定化 His6-ATA-117 也在干燥器中于 25°C 脱水 24 小时，以验证深度脱水处理对生物催化剂的影响。

数据表明 EziG 载体具有中等吸水能力，范围为 2.7 至 4.7 (% w/w)。 这很可能是有机聚合物涂层的结果，因为之前对多孔硅质材料吸水性的研究表明，吸水性很大程度上取决于材料的极性和孔隙的大小。 例如，煅烧的多孔硅藻土（一种由硅藻土组成的二氧化硅基体）被分解并随后再加工，以生产具有受控孔隙率的多孔颗粒，该颗粒可以保留高达其重量的 90% 的水。

当载体用水缓冲液洗涤时，在25°C和100毫巴下脱水24小时去除大部分残留水。 然而，多元醇的吸湿性使得 25°C 下的真空干燥过程无效，反而会从环境中吸收额外的水分，高达 20% w/w。 值得一提的是，所有样品均置于同一干燥器中，且在 24 小时干燥过程结束时仅打开一次。 用 iPrOH 和甲苯冲洗的样品在干燥过程后显示出最小的重量差异。 这可归因于残余水和痕量有机溶剂的蒸发。

总之，当用所有不同的水性缓冲液洗涤时，保留极性 iPrOH 的固定化 His6-ATA-117 的所有不同配方都可以有效地去除大部分与支持物结合的水。

最后使用标准活性测定在水介质中评估所有预处理的固定化 His6-ATA-117 制剂的活性，以验证所有预处理对生物催化剂活性的影响，从 α-甲基苄胺开始，以丙酮酸钠作为胺受体结束 15分钟，固定化后的活性比天然酶的活性低2.9倍。

在水介质中报告的模型反应中，EziG1-Opal 比 EziG2-Coral 和 EziG3-Amber 更活跃（高出 50%）。 值得注意的是，EziG1-Opal 的表面具有最高的亲水性，且基质具有最宽的孔隙（500A，而 EziG2-Coral 和 EziG3-Amber 为 300A）：这些特性的组合似乎有利于这种特殊的反应。

除了 EziG1 -Opal 制剂的预处理 5（iPrOH + 甲苯冲洗）外，预处理方案没有显着效果，该制剂迄今为止显示出最高的活性，因此，从这些实验观察开始，我们计划进行详细的光谱分析，以收集 His6-ATA-117 酶固定在三个暴露于不同洗涤和脱水程序的 EziG 支持物上后的行为的直接观察结果。

«——[·固定化His6-ATA-117酶的光谱表征·]——»

使用红外振动显微光谱和成像对固定生物催化剂进行定位和结构表征。 事实上，FTIR 光谱对蛋白质的二级结构很敏感，并且可以在 FTIR 光谱中识别蛋白质的两个显着特征。

根据不同的氢键环境（α-螺旋、β-折叠、旋转、无序构象），酰胺I带的光谱形状发生变化，这可能与蛋白质的二级结构有关。 事实上，大多数蛋白质都具有二级结构元素的混合物，而酰胺I带就是这些成分的组合。 一般来说，α-螺旋和β-折叠的酰胺I振动频率分别在1655和-1左右。

在五种不同的预处理后进行 FTIR 测量。 对于所有制备的样品，收集单点光谱图像和红外高光谱图像。 由于其高孔隙率，除了饱和二氧化硅之外，无需任何其他处理即可分析样品透射率。 在此阶段，蛋白质的光谱区域特征基本上不含可能阻碍振动分析的载体光谱特征。

FTIR 高光谱图像对于将化学信息与样品形态联系起来特别有用。 通过绘制归一化为玻璃支持物厚度的酰胺 I 和 II 带的强度获得的高光谱图像表明酶在支持物的边界区域积聚。 然而分析指出，蛋白质在内部区域也有显着的渗透。

«——[·利用荧光共聚焦显微镜分析His6-ATA-117在EziG载体上的空间分布·]——»

FTIR成像是一种非共焦显微镜技术，不允许区分酶的表面和核心渗透，因此，为了重新确认酶在载体表面的分布并获得其沿载体深度渗透的信息，我们使用共焦激光扫描显微镜（CLSM）成像，为此目的，我们用 FITC 对 His6-ATA-117 进行化学标记，然后将其固定化以供研究。

我们发现His6-ATA-117主要位于外部区域，所有三种载体的分布模式与FTIR成像观察到的相似，并且酶的分布和积累因一种珠子而异于一种载体类型（EziG1-蛋白石、EziG2-珊瑚或 EziG3-琥珀）彼此不同，并且由于它们没有规则的形状或大小，因此在所有三种载体中，酶以不同的平均深度渗透到载体的核心。

为了表征固定化酶的构象，我们测量了纯酶的红外吸收并将其用作参考，并且为了分析，我们比较了干燥步骤之前使用的所有类型的预处理的酰胺 I-酰胺 II 光谱范围。 光谱的二阶导数，在载体边界区域平均获得2048次扫描，横向分辨率设置为50×50μm2，在牺牲空间分辨率的同时提高光谱质量。

固定化酶的二阶导数光谱在~−1处有一个主峰，在~−1处有一个主峰，分别归因于蛋白质的α螺旋结构和β折叠结构，以及小组分在~−1 处出现分子间β-折叠吸收的光谱区域。

可以看出，用缓冲溶液（蓝色）洗涤的所有制剂的二阶导数光谱与使用纯游离酶的制剂（橙色）相似。 分析后，样品用有机溶剂（iPrOH 和甲苯）预处理，所有三个载体的 -1 附近的带强度均增加。 当酶暴露于有机溶剂时，发生构象重排。 这可能是因为蛋白质倾向于重新排列，使得亲水部分和疏水部分之间存在间隙。 以达到稳定的构象。

为了验证重排是否是由极性吸湿性异丙醇处理引起的，我们制备了新的固定化His6-ATA-117-EziG1-Opal样品，并在干燥前仅用iPrOH对其进行预处理，并将新光谱与预处理的注册光谱进行比较，确认仅当酶暴露于非极性溶剂（例如甲苯）时，才会观察到蛋白质错误折叠。

当观察 FTIR 图像中矢量所有边界和中心的随机点时，发现带有甲苯构象变化的预处理 5 似乎在矢量中到处都发生，尽管这与预处理时甲苯构象发生一些变化的情况不同。在载体的外部观察到蛋白质。

“——【·作者认为·】——”

光谱研究强调了用 iPrOH 洗涤的固定化 His6-ATA-117 的所有制剂都具有有利的 β-折叠构象，并证实接触甲苯促进了三个 EziG 支持物上酶的修饰、构象变化，实验数据表明，这种构象修饰不是有利于固定 His-6-ATA-117 的活性，但可能会发生过度激活，如观察到，当用简单的缓冲溶液处理制剂时，His-6-ATA-117-EziG1-Opal 的活性几乎加倍。

因此，本研究继续研究His6-ATA-117-EziG1-Opal在有机溶剂中的转氨基反应中的表现。 我们选择甲苯作为反应介质，以减少可能影响固定化酶构象和活性的变量。 不同的实验研究红外显微镜光谱和成像的集成，加上共焦显微镜，为建立疏水性有机溶剂（甲苯）中ω-转氨酶活性的保存提供了必要的信息，不仅可以直接观察固定化转氨酶的分布不仅如此，还揭示了暴露于甲苯后β-片层固定转氨酶结构域的特定构象变化。

“ - 【·参考·】 - ”

、 和 ，“非水溶剂中的酶学研究”，2001 年。

，“固定化蛋白质及其用途”，2021 年。

加西亚-鲁伊斯，“微孔介孔材料”，2019。

，食品中的水分活度：基础知识和应用，2020 年。