三十年难题终破解：万能生物催化剂P450全长晶体结构获揭示

作者丨李晨

2020年5月29日，《自然通讯》在线发表了首个细胞色素P450酶的全长精细三维结构，解决了这一数十年来悬而未决的科学难题。

该工作由湖北大学生命科学学院和省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室陈春启、马立新、郭瑞婷教授合作完成。

他们解析了 P450 酶的晶体结构，并阐明了电子如何在分子内转移。

这为理解P450的结构和完整机制提供了重要指导，对于P450酶在医学和工业中的应用具有重要价值。

通用生物催化剂

细胞色素P450是1955年首次在小鼠肝细胞中发现的一种酶蛋白。因其与一氧化碳结合的还原态吸收光谱的波长约为450 nm而得名。

该蛋白由血红素结构域和含有黄素单核苷酸（FMN）的还原酶结构域组成；这两部分通过含有铁硫簇的铁氧还蛋白结构域连接。

“细胞色素P450是一个大的酶家族，简称CYP，参与许多天然产物的合成途径以及毒物和药物的代谢反应。” 论文通讯作者陈春奇告诉中国科学报，在植物中，P450家族参与一些特殊化合物的合成，比如青蒿素、紫杉醇等；在人体内，P450家族主要参与解毒过程，例如分解可致癌的黄曲霉毒素。

这是因为P450具有很高的催化通用性，参与20多种反应，包括羟基化反应、环氧化反应和成环反应。

其底物谱极其广泛，可识别芳香族、聚酮化合物、萜类化合物、肽类、糖类等多种类型的底物，被誉为“万能生物催化剂”。

它还具有较高的区域选择性和立体选择性，可以特异性识别结构位点和方向。

此外，P450酶的底物结合区域具有高度可塑性，可以通过酶工程改变底物谱，在重要化学品和药物的制造中具有巨大的应用潜力。

因此，药物的活化和代谢主要由CYP酶家族负责，该家族约占生物体此类代谢的75%。

P450系统广泛存在于所有生物甚至病毒中，目前已发现18000多个P450系统。人体内已发现超过57个P450系统，其中大部分是膜蛋白，主要分布在线粒体内膜或内质网中。

然而，在大肠杆菌中没有发现这种酶蛋白的踪迹。

“大多数 P450 酶需要氧化还原酶提供电子来激活底物结合区域的血红素，然后转化底物。” 陈春奇表示，建立P450系统，必须找到同源或匹配的氧化还原酶。

P450系统的9个家族中，只有两个家族在同一条多肽链上拥有自己的氧化还原酶，称为自给自足的P450酶。这些酶主要来自细菌。

其他P450系统需要来自外界的匹配氧化还原酶，这主要发生在动物中。

“自给自足的 P450 酶对于生物技术应用来说是非常有吸引力的生物催化剂。因此，电子如何在自给自足的 P450 酶内部转移是一个非常有趣且重要的话题。” 论文通讯作者郭瑞廷告诉《中国科学报》，此前，科学家们已经明确研究了P450系统中的血红素和FMN等域，但仍然对中间连接部分不了解，缺乏全长精细结构。结构。

“在蛋白质纯化和晶体培养过程中，P450酶很容易在中间断裂或降解，很难获得完整的全长三维结构。” 陈春奇说道。

获得全长P450的精细三维结构

目前已知有两种类型的自给自足的 P450 酶。

第一类以巨大芽孢杆菌为代表，其由氮末端的血红素结构域和碳末端的P450还原酶（CPR）组成。电子转移的方向是从碳端到氮端。

尽管该类P450酶的全长精细结构仍然缺失，但关于该类P450酶的电子传递机制已有一些粗略的理论。

图1 第一类自给自足P450酶的结构域排列 (a) 结构域分布图; （b）部分晶体结构（PDB ID，1BVY），绿色区域为血红素结合域，粉色区域为FMN结合域，红色虚线标记为FMN与血红素之间的直线距离，长度为括号（单位，Å）； (c)几种CPR晶体结构，黄色是FAD/NADPH结合域，橙色是铰链区，粉色也是FMN结合域。最左边是源自大鼠的CPR（PDB ID，1AMO），在“”构型中，中间和右边分别是源自大鼠的CPR（PDB ID，3ES9）和酵母-人融合物（PDB ID，3FJO）。，处于“开放”配置。蛋白质中结合的所有辅酶均以棒模型表示。

第二类是本研究涉及的属于这一类。

这种类型的 P450 由 N 端血红素结构域和 C 端邻苯二甲酸双加氧酶还原酶样结构域 (PDR) 组成。 PDR 包含一个 FMN 依赖性还原酶结构域和一个铁氧还蛋白结构域。

图2 第二类自给自足P450酶的结构域排列 (a) 结构域分布图; (b) 使用 PDR 作为电子供体的结合域和铁氧还蛋白复合物的结构。左图和中图：带有假单胞菌氧化还原蛋白；右：皮质铁氧还蛋白。绿色区域为血红素结合域，粉色区域为[2Fe-2S]结合域，红色虚线标记[2Fe-2S]与血红素之间的直线距离，长度（单位，Å）为括号中，蛋白质辅酶中的所有结合都以杆状模型表示。

自给自足的 P450 酶如何将电子从多肽链中血红素的碳末端转移到氮末端？由于30多年来长期缺乏全长蛋白质结构信息，这项研究之前还不清楚。

“获得全长酶是一项了不起的成就，”英国曼彻斯特大学化学生物学教授 L. 说。许多小组，包括她自己的小组，都试图解决这些结构，因为它们作为生物催化剂具有巨大的应用潜力。

“可以说，晶体制备已经超越了科学，几乎成为了一门艺术。” 陈春奇表示，获得大蛋白质的完整晶体结构是很困难的。

本次研究使用的材料相对稳定，再加上郭瑞廷多年来在晶体制备和结构分析方面的丰富经验，他们能够利用X射线晶体学分析其完整的晶体结构。

结构分析表明，在该酶中，FMN距离铁硫簇足够近，可以实现直接电子转移；但血红素距离铁硫簇太远，无法直接进行电子转移，而是依靠五个“定位”氨基酸来实现转移。

“我们分析了全长晶体结构并建立了清晰的酶结构模型。” 郭瑞廷表示，这种连续的多肽从氮端到碳端折叠成三个结构域，通过两个连接肽连接起来。最终顺序是：血红素结合域、还原酶域和铁氧还蛋白域。

图3 总体结构图（上）三个结构域分别通过1和2连接。图中分别标出了氮端（N）、碳端（C）和结合的配体；（下）三个结构域对应的氨基酸编号。

郭瑞廷表示，经过结构分析，发现三个结构域的排列与电子转移方向非常一致。

血红素结合域的底物结合区域朝外，有利于底物进入结合，说明结构排列相当合理。

其中，还原酶结构域与铁氧还蛋白结构域之间的直线距离为7.9Å，有利于电子的直接转移。

“科学家普遍认为小于8Å的距离可以直接由电子转移。” 郭瑞婷说道。

另一方面，铁氧还蛋白结构域与血红素之间的直线距离达到25.3Å，超过了目前公认的有效直接电子转移距离。

图4 分子内电子转移途径 (a) 粗箭头表示电子转移方向，虚线箭头表示底物()进入活性口袋的方向，三个氧化还原中心之间的虚线与括号内的值标出它们之间的距离直线距离（单位，Å）； (b) FMN C8 上的甲基与 [2Fe-2S] 的 Fe2 之间的传递路径由虚线表示。可能涉及[2Fe-2S]和血红素之间电子转移的氨基酸主链和侧链可能发挥电子传输作用的氨基酸也用星号标记。氨基酸由杆模型表示，而其主链由球模型标记。

5个“二传手”传递电子

“在这两个氧化还原中心之间，其他辅助因子帮助电子传输的可能性很低。” 郭瑞廷解释说，因为结构显示两者之间的通道较窄，缺乏其他辅因子的结合特征。

另一方面，考虑到氨基酸也是电子载体，两者之间的氨基酸也可能在电子传递过程中发挥重要作用。

“现在我们有机会设计还原酶结构域和电子转移途径。” 陈春奇说道。

为了分析这些氨基酸的侧链基团对酶活性的影响，他们将这些位点突变为丙氨酸，并测量产生的产物量，以评估每种氨基酸的作用。

郭瑞廷介绍，酶活性检测结果显示，R388、R718、E723、S726、E729的丙氨酸突变体活性明显下降。

通过再次校准结构上的这些位点，可以看到电子转移的大致方向。

R378A突变蛋白缺乏血红素引起的红色，一氧化碳处理后没有吸收峰带移。

另外，R378的位置与血红素相邻，推测R378可能与结合血红素有关。

因此，R378A突变引起的影响更为复杂，还需要进一步的实验来确定该位点对电子传输的影响。

图5 [2Fe-2S]和血红素通道氨基酸突变验证 (a) 野生型(WT)和每个突变的重组蛋白的活性。野生型的百分比显示为百分比，其他突变的百分比显示为平均值±标准差，用于计算平均值的每个单个值由圆圈表示。 UD，。 *, R378 不含血红素且无活性。 (b) 与图4b相同，侧链突变后活性降低的氨基酸被突出显示。

“了解了氨基酸在电子传递过程中的作用后，我们就可以考虑更换其他有效的氨基酸来提高电子传递效率。” 郭瑞廷解释说，这就像更换了手更长的“二传”。，使电子能够更快地通过。

这种设计将提高催化反应的效率。 P450全长结构的分析对于理解自给自足的P450酶的催化机制是一个非常重要的里程碑，对于P450酶的转化和应用具有重要的指导意义。

陈春启教授收集数据时