本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种生物催化剂及其制备方法和应用。
背景技术：
(R)-3-（分子式，分子量127.18，CAS号：25333-42-0）是阿地溴铵、索利那新、瑞伐托酯、他沙利定等药物合成的关键。 中间的。 目前业界主要采用手性催化剂不对称还原3-奎尼酮来合成(R)-3-奎尼多醇，如：/PICA-(II)络合物或BINAP/IPHAN-Ru(II)络合物等。 然而，这种化学合成方法需要筛选手性配体； 所使用的过渡金属价格昂贵、剧毒且难以从产品中去除； 所制备的产物光学纯度较低，需要进一步纯化。 另一种方法是外消旋拆分。 该方法的缺点是其理论收率最多只有50%。
与化学合成方法相比，以酶为催化剂的生物合成方法具有底物特异性等独特优势； 高化学选择性、区域选择性和立体选择性； 反应条件温和； 高催化活性； 和良好的原子经济性。 (R)-3-奎尼醇的生物合成涉及两个过程：一是在羰基还原酶的帮助下，用NADH或NADPH将3-奎尼酮还原为(R)-3-奎醇； 另一种是辅酶的再生，该酶将氧化型NAD+或NADP+转化为还原型NADH或NADPH，实现双酶偶联不对称还原合成(R)-3-奎尼醇。 具体流程如下：
(R)-3-奎因醇的生物催化不对称还原合成。
无论是野生型微生物还是重组大肠杆菌作为生物催化剂，由于细胞自身结构的限制，细胞内外底物/产物和辅酶的交换受阻，导致生物转化时间长、催化效率低。 当使用游离酶作为催化剂时，酶的稳定性以及酶纯化带来的高成本都是酶作为生物催化剂必须解决的问题。 此外，这两种生物催化剂都难以回收和循环利用。
在实际应用中，为了提高酶的稳定性、催化活性和选择性，可以将酶与特定载体结合形成固定化酶。 固定化酶生物催化剂易于与反应混合物分离，可回收再利用，可实现连续反应。 (,, J. 和, 使用,Chem.Soc.Rev.,2013,42,6437-6474;,Colin L. 和 A.Weiss,快速薄膜流动,Chem..,2016,52,10159- 10162）。 传统的酶固定化方法包括物理吸附、化学结合、封装和形成交联酶聚集体。 物理方法简单、快速、不易灭活酶，但酶易泄漏，且载体本身易堵塞酶的活性位点，阻碍底物结合。 化学方法有利于增加酶的稳定性，但容易造成酶失活(Suwan Myung, Chun You and Y.-H.Zhang, - : of - - and a , J.Mater.Chem.B, 2013,1,4419 -4427;Wen Wang, 和Zhi Li, of 和 : and of in one pot with Ni-NTA,Chem..,2011,47,8115–8117;Fuhua Zhu,Hui Li,Yijun Jiang, Wang 和 Mu,Co - 通过非键形成多对氧化物：用于一锅酸，来自 Green Chem., 2014, 16, 2558-2565)。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的问题，根据本发明的第一方面，本发明的目的是提供一种稳定性好、催化活性好、长期运行稳定性好且可回收利用的生物催化剂。
本发明的目的是这样实现的：
一种生物催化剂，包含NADH依赖性特异性3-醌还原酶(QNR)、葡萄糖脱氢酶(GDH)和Ni2+功能化琼脂糖微球，其特征在于：衍射角2θ为27.5±0.2°，在31.7±0.2°处有衍射峰， 45.5±0.2°、52.1±0.2°、66.4±0.2°和75.8±0.2°。
根据本发明的一实施例，上述的生物催化剂还包含氯化钠及磷酸二氢钠。
根据本发明的一实施例，上述的生物催化剂具有泡沫状多孔结构，孔径为10nm-2.5μm。
根据本发明的一实施例，上述的生物催化剂酶载量为5-15％。
根据本发明的第二方面，本发明的另一个目的是提供一种制备上述生物催化剂的方法。
根据本发明的一个实施例，上述生物催化剂的制备方法，其特征在于，采用以下步骤：
步骤1）
用缓冲溶液 A 平衡 Ni2+ 功能化琼脂糖微球，并添加含有组氨酸标记的 3-醌还原酶 (His-QNR) 和组氨酸标记的葡萄糖脱氢酶 (His-GDH) 的溶液。 将细胞裂解混合上清液用含有5-15mM咪唑的缓冲液A稀释成悬浮液；
第2步）
将步骤(1)制备的悬浮液在温度4～30℃、pH 5.0～10.0、转速30～30℃下连续搅拌1～3小时； 然后离心，收集载酶琼脂糖微球，用步骤(1))用缓冲液A洗涤；
步骤（3）
将洗涤后的载酶琼脂糖微球分散于步骤（1）的缓冲液A中，置于2-8℃冰箱中孵育1-5天； 获得了什么；
缓冲液A的pH值为7.8-8.2。
根据本发明的一实施例，上述缓冲液A含有50mM磷酸二氢钠和300mM氯化钠。
根据本发明的第三方面，本发明的另一个目的是提供上述生物催化剂在合成(R)-3-奎宁醇中的应用。
根据本发明的第四方面，本发明的另一个目的是提供一种(R)-3-奎宁醇的合成方法，该方法利用上述的生物催化剂进行酶催化反应来合成(R)-3-奎宁醇。 -3-奎尼醇。 宁淳.
根据本发明的一个实施例，一种(R)-3-奎醇的合成方法，其特征在于：
将生物催化剂分散于缓冲液B中，加入3-醌、葡萄糖、NAD+和NADH，室温pH为7.5-8.0，转速50°振荡，生物转化时间1-12h； 缓冲液B的pH值为7.2-7.4。
根据本发明的一实施例，缓冲溶液B为10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其含有137mM NaCl和2.7mM KCl。
具体地，一种(R)-3-奎宁醇的生物催化合成方法，包括以下步骤：
步骤1）
用缓冲溶液 A 平衡 Ni2+ 功能化琼脂糖微球，并添加含有组氨酸标记的 3-醌还原酶 (His-QNR) 和组氨酸标记的葡萄糖脱氢酶 (His-GDH) 的溶液。 将细胞裂解混合上清液用含有5-15mM咪唑的缓冲液A稀释成悬浮液；
第2步）
将步骤(1)制备的悬浮液在温度4～30℃、pH 5.0～10.0、转速30～30℃下连续搅拌1～3小时； 然后离心，收集载酶琼脂糖微球，用步骤(1))用缓冲液A洗涤；
步骤（3）
将洗涤后的载酶琼脂糖微球分散于步骤(1)的缓冲液A中，置于2～8℃冰箱中孵育1～5天； 制备生物催化剂；
步骤4）
将生物催化剂分散在缓冲溶液B中，添加3-醌、葡萄糖、NAD+和NADH。 室温下pH为7.5-8.0，转速50~摇匀，生物转化时间1-12h；
缓冲液A含有50mM磷酸二氢钠和300mM氯化钠，pH值为7.8-8.2；
缓冲液B为10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)，含有137mM NaCl、2.7mM KCl，pH值为7.2-7.4。
有益效果：
1、本发明基于Ni2+与多聚组氨酸标签之间的强亲和力，直接从细胞裂解液中同时纯化并固定His-QNR和His-GDH。 制备的生物催化剂的衍射角2θ为27.5±0.2°，在31.7±0.2°、45.5±0.2°、52.1±0.2°、66.4±0.2°、75.8±0.2°处有衍射峰。 该生物催化剂具有泡沫状多孔结构，孔径为10nm-2.5μm，酶负载量高达5-15%，具有良好的催化活性。
2、采用本发明的生物催化剂作为固定化酶催化剂用于生物催化合成(R)-3-奎宁醇，无需添加昂贵的辅酶NADH，即可同时实现羰基还原和辅酶原位再生。 同时，本发明的生物催化剂可回收循环利用，具有长期运行稳定性。
3、本发明的酶固定化方法不需要对目的蛋白进行预纯化，可以同时完成目的蛋白的纯化和固定化； 同时可以特异性富集目的蛋白的活性； 制备的固定化酶稳定性好，方法操作简单。 不需要特殊设备，工艺条件温和，成本低，适合工业化。
4、利用本发明的生物催化剂不对称合成(R)-3-奎宁醇，收率高达70-85%，转化率100%，对映体值100%，可循环利用超过15次。 经济效益是巨大的。 本发明生物催化不对称合成(R)-3-奎宁醇所用介质为水，节约资源，不污染环境，符合绿色化学的要求。
附图说明
图1为生物催化剂的SDS-PAGE分析；
图2为温度对Ni2+功能化琼脂糖微球载酶量的影响；
图3 pH值对Ni2+功能化琼脂糖微球载酶量的影响；
图4 Ni2+功能化琼脂糖微球与总蛋白质量比对酶比活性和活性回收率的影响；
图5为生物催化剂的扫描电镜分析图；
图6为生物催化剂的粉末X射线衍射分析；
图7为生物催化剂的热重分析图；
图8为3-奎尼酮和(R)-3-奎尼多醇的红外光谱分析；
图9展示了生物催化剂的回收和再利用；
图10是来自不同循环批次的生物催化剂的SDS-PAGE分析。
详细方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。 需要指出的是，以下实施例仅用于进一步说明本发明，不能理解为对本发明保护范围的限制。 本领域技术人员可以根据上述发明内容做出对本发明的判断。 一些非必要的改进和调整。 本发明所有原料和试剂均为市售产品。 本发明中使用的羰基还原酶是NADH依赖性特异性3-醌还原酶(QNR，No：)，辅酶再生酶是葡萄糖脱氢酶(GDH，No：)。
实施例1
酶活性测定
QNR酶活性测定：
标准反应混合体系：缓冲液B（PBS，pH7.2-7.4）、3μmol 3-醌、0.3μmol NADH、酶QNR适量，总体积1 mL。 在 λ = 340 nm 处测量吸光度值的变化。 酶活力单位定义：25℃下1分钟内转化1μmol NADH所需的酶量。
GDH酶活性测定：
标准反应混合体系：缓冲液B（PBS，pH7.2-7.4）、10 μmol葡萄糖、1 μmol NAD+、酶GDH适量，总体积1 mL。 在 λ = 340 nm 处测量吸光度值的变化。 酶活力单位定义：25℃下1分钟内转化1μmol NAD+所需的酶量。
实施例2
His-QNR 和 His-GDH 的共固定化
取50mg Ni2+功能化琼脂糖微球，用缓冲液A（含50mM磷酸二氢钠和300mM氯化钠，pH值7.8-8.2）平衡； 然后加入2mL含有奎尼酮还原酶(His-QNR)的细胞裂解上清液与葡萄糖脱氢酶(His-GDH)混合，并用含有10mM咪唑的缓冲溶液A稀释至5mL。 在25℃的温度、8.0的pH和50rpm的转速下，将上述悬浮液连续搅拌2小时。 将上述悬浮液离心，收集载酶琼脂糖微球，用缓冲液A洗涤两次。将洗涤后的载酶琼脂糖微球重新分散在缓冲液A中，在冰箱中4℃孵育4天。
实施例2制备的生物催化剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析
SDS-PAGE分析结果如图1所示。图中，M为标准蛋白分子量； L1为表达His-QNR的重组大肠杆菌和表达His-GDH的重组大肠杆菌； L2为两种重组大肠杆菌的细胞裂解混合上清； L3、L4、L5、L6 为10mM、250mM、500mM、1M洗脱生物催化剂的收集液。 分子量35-25kDa之间出现两条明显的蛋白条带，分别对应QNR（25.74kDa）和GDH（28.25kDa）。 目的蛋白的纯度均在90％以上，证实了本发明提供的亲和固定化方法。 His-QNR 和 His-GDH 可以同时从细胞裂解液中纯化并直接固定。
参照实施例2的制备方法，考察了温度和pH值对Ni2+功能化琼脂糖微球载酶量和载酶效率的影响； 通过Ni2+功能化琼脂糖微球与总蛋白质量的比较，比较酶比活性和活性恢复率的影响。
温度对Ni2+功能化琼脂糖微球载酶量和载酶效率的影响结果如图2所示。当温度从4℃升高到25℃时，载酶量从27.5mg/增加到59.6mg/ g（Ni2+功能化琼脂糖微球），负载效率从51.6%提高到89.7%。 当温度超过30℃时，酶的负载量和负载效率并未增加，表明固定化的最佳温度为25℃。
pH对Ni2+功能化琼脂糖微球载酶量和载量效率的影响结果如图3所示。当温度为25℃、pH值为8.0时，载酶量达到最大值60.8mg /g（Ni2+功能化琼脂糖微球），载酶效率达到最大值92.3%。 因此，固定化的最佳pH值为8.0。
Ni2+功能化琼脂糖微球与总蛋白质量比对酶比活力和活力回收率的影响如图4所示。当Ni2+功能化琼脂糖微球与总蛋白质量比从4/1增加到8/1时，比活力和活力回收率的变化如图4所示。 QNR和GDH活性分别从5.3U/mg增加到8.4U/mg和5.6U/mg。 11.5U/mg，活性恢复率分别从61.2%提高到94.6%和64.2%提高到98.6%。 但当质量比从8/1增加到10/1时，比活度和活性恢复率变化不大。 固定化酶时，Ni2+功能化琼脂糖微球与总蛋白的质量比为8/1。
实施例2制备的生物催化剂的扫描电镜分析
将样品溶液滴在干净的盖玻片上，40℃真空干燥，喷金，用扫描电子显微镜（SEM，S-3000N型）和场发射扫描电子显微镜（FE-扫描电镜，FEI NOVA 400）。 结果如图5所示。图5a显示了具有光滑表面的Ni2+功能化琼脂糖微球。 图5b为固定化酶后的Ni2+功能化琼脂糖微球，即生物催化剂。 其表面形貌与图5a所示完全不同。 出现大小形状不规则、相互紧密相连的小珠子。 通过FE-SEM对生物催化剂的进一步分析表明，生物催化剂的表面具有泡沫状多孔结构，孔径在10 nm至2.5 μm之间（图5c，d）。 这种多孔结构有利于高浓度底物的局部富集/辅酶与物质的快速交换，不仅可以提高反应速度，还可以提高催化效率。
实施例2制备的生物催化剂的粉末X射线衍射(XRD)分析
使用XD-2X射线衍射仪测量样品晶体衍射峰。 测试条件：Cu靶电压30kV，电流15mA，扫描速度2°/min，步长0.02°，扫描范围5°～50°，分析结果如图6所示。从图中可以看出：生物催化剂的XRD谱，2θ出现在27.5±0.2°、31.7±0.2°、45.5±0.2°、52.1±0.2°、66.4±0.2°和75.8±0.2°处。 强度分布为845、1450、1005、850、800和830。但蛋白质和Ni2+功能化琼脂糖微球的XRD谱中没有相应的特征峰。
实施例2制备的生物催化剂的热重分析(TGA)
使用该系统确定生物催化剂的酶负载量。 将约2mg样品放入铝锅中，以20mL/min通入氮气，加热速度为15℃/min，扫描范围为30-600℃。 TGA分析结果如图7所示。根据失重计算，生物催化剂酶负载量为5.94%。
实施例3
(R)-3-奎醇的生物催化不对称合成：
反应体系：50mg生物催化剂，5mM 3-醌，9mM葡萄糖，0.05mM NAD+和0.05mM NADH，缓冲液B（10mM磷酸盐缓冲盐水，PBS），含NaCl 137mM，KCl 2.7mM，，，pH值为7.2-7.4 ），总体积为10mL。 反应温度为25℃并持续搅拌。 反应过程中pH控制在7.5-8.0。 通过TLC监测反应。 流动相为V二氯甲烷/V甲醇=9/1。 生物转化完成后，将反应混合物离心以分离生物催化剂。 用高浓度NaOH调节上清液的pH值大于12，然后在80℃下减压浓缩至总体积的1/4。 加入等体积正丁醇萃取3次，收集有机相，减压浓缩，蒸干。 将固体在90℃下用甲苯溶解，趁热过滤不溶物，冷却滤液，得白色针状晶体。 过滤得到白色固体(1H-NMR(,DMSO):δ4.946(s,1H),δ3.879(q,1H),δ2.531-3.164(m,6H),δ1.392-2.014( m，5H)，产物的理论分子量为：127.18，质谱测定为：127)。
对实施例3制备的白色固体进行红外光谱分析和构型分析
红外光谱分析：采用KBr压片法制备样品，扫描波长范围为4000~400cm-1。 底物和产物的红外光谱如图8所示。结果表明，3-醌酮-1附近的羰基特征峰消失，而羟基的特征峰出现在-1处，表明3-醌-醌被还原为3-醌醇。
配置分析
对映体值测定使用系统（Elmer，美国），手性柱为（-β-6-TBDM，25m×0.25mm×0.25μm，-Nagel），使用氢火焰离子化检测器。 将温度从 60°C 编程至 180°C，加热速率为 5°C/min，并保持 3 分钟。 喷射器和检查器的温度分别为220°C和250°C。 以标准品(R)和(S)-奎宁醇为对照，测得产品对映体值为100%，构型为R。
参考实施例3，研究了底物和催化剂的量对转化时间、转化率和对映体值的影响。 详细信息请参见下表 1。
当生物催化剂用量为底物的6.12%时，随着底物用量的增加，生物转化时间由1.0h增加到4.5h，转化率和对映体值均为100%。 当底物量为204g/L、催化剂减半时，转化时间为9.5h，催化活性明显降低，转化率低于100%，对映体值仍为100%。 表明底物的量影响生物催化剂的活性并延长转化时间，但不影响其立体选择性。
实施例4
生物催化剂的回收和循环利用。
反应体系：100mg生物催化剂、10mM醌、18mM葡萄糖、0.05mM NAD+和0.05mM NADH、缓冲液B（PBS，pH7.2-7.4），总体积10mL。 反应温度为25℃并持续搅拌。 反应过程中pH控制在7.5-8.0。 TLC监测反应。 反应完成后，离心收集催化剂，直接用于下一步转化。 发现本发明提供的生物催化剂可循环使用15次，单次循环转化率和对映体值均为100％。 结果如图9所示。15次循环后，催化效率明显下降。 在生物催化剂回收过程中，第2次、第4次、第6次、第20次转化后，取出少量催化剂进行SDS-PAGE分析。 结果如图10所示。发现在生物催化剂的回收过程中，固定化酶的量没有明显减少，说明本发明提供的生物催化剂具有长期运行稳定性。
实施例5(比较例)
表达His-QNR和His-GDH的重组大肠杆菌未经本发明的生物催化剂处理，直接用于实验中进行比较。 反应体系：0.1g混合湿细胞作为生物催化剂，5mM 3-醌，9mM葡萄糖，0.05mM NAD+和0.05mM NADH，缓冲溶液B（PBS，pH7.2-7.4），总体积10mL。 反应温度为25℃并持续搅拌。 反应过程中pH控制在7.5-8.0。 使用TLC监测反应。 流动相为V二氯甲烷/V甲醇=9/1。 转化时间显着延长（5.5h），转化率为95%，对映体值为100%，且无法回收循环利用。