生物催化剂的高通量筛选方法.docx
（1.石家庄华数药业集团，河北石家庄；2.河北化工医药职业技术学院，河北石家庄）生物催化技术是最有前景的工业可持续发展技术，生物催化剂具有良好的应用前景。 介绍了生物催化剂高通量筛选的常用方法。 关键词】生物催化剂； 高通量； 筛查； 方法 文章编号]1003-5095 (2009) 07-0049-03 生物催化是利用酶或生物体作为催化剂实现化学转化的过程。 具有条件温和、高效专一、环境友好等特点，产生了显着的社会效益和经济效益。 生物催化技术被认为是可持续工业发展最有前途的技术。 生物催化反应具有高度的化学区域和对映选择性，特别适用于医药、食品、农业等化工产品的合成和制备。 生物催化手性合成反应条件温和、无毒、无污染、能耗低、环境友好、高效、高选择性。 是手性合成方法研究的热点和发展方向。 与化学催化剂相比，细胞和酶作为生物催化剂的优点是：对映选择性和区域选择性； 反应温度要求低（0-110℃）； 能耗低； 在pH 2-12范围内具有活性； 产品较少； 正确使用时无毒； 可重复使用（固定）； 可生物降解； 并且可以无限量生产。 缺点：高温下不稳定； 在极端pH条件下不稳定； 在聚合溶剂中不稳定，会受到一些金属颗粒的抑制，种类少，发现和改进周期太长； 会被蛋白酶水解，有的价格昂贵； 有些需要昂贵的辅助基材等。
酶作为生物催化剂，在手性合成方面具有良好的应用前景，但天然酶蛋白的理化性质很可能不适合工业生产过程。 在过去的5到10年里，生物催化经历了几次重大变革：包括从大量酶源中高通量筛选生物催化剂、生物催化的平行实验技术和设备、基因和蛋白质组学发展带来的廉价测序技术、为优化而开发的定向进化技术。 高通量筛选更容易找到能完成特定反应的生物催化剂（收稿日期：2009-02-04 作者简介） 宋连明（1972-），男，助理工程师，从事质量管理和药物分析工作工作。 HTS）是近年来发展起来的一种新型筛选技术。 它具有微量、快速、灵敏的特点，可以在短时间内检测大量微生物。 高通量筛选是应用先进的技术手段，对大量筛选样品的催化活性同时进行分析和评价，筛选出具有高催化活性的酶的过程。 酶活性检测方法发明的动力很大程度上来自于酶的发现和改造。 酶工程导致人们越来越认识和利用酶进行生产，特别是在精细化学品合成领域。 高通量筛选的理想分析系统应该能够自动化微孔板的每个孔，并且应该能够同时进行不同的检测方法。 当前高通量筛选的重点是开发一种简单且灵敏的检测技术，使得在检测条件下活性很低的酶也能被监测。
高通量筛选中现已建立了比色法、发光法和荧光法等自动检测方法。 使用显色底物直接检测颜色变化是跟踪酶反应的最简单方法，例如使用对硝基苯基衍生物来检测水解酶活性。 常用的模拟水解酶天然底物的对硝基苯衍生物包括对硝基苯酯胰岛素和对硝基苯磷酸胆碱。 每个模拟基板被添加到公共基板上。 根据水解释放出的黄色对硝基苯酚或对硝基苯胺可检测对硝基苯基。 pH指示剂法是大多数酶不能直接引起颜色变化。 为了检测不带显色基团的底物的反应，需要将反应产物转化为有色化合物。 pH指示剂检测是常用的方法。 基于pH指示剂的酶活性检测是快速判断酶是否能与特定底物发生反应的方法。 该方法可以快速消除更复杂的后续实验中不匹配的酶或底物。 第32卷No. 缓冲溶液和pH指示剂的选择是pH指示剂测试中最重要的变量。 pH指示剂筛选方法的优点：（1）比传统筛选方法快数百倍，96孔格式可以同时分析大量样品，并且与薄层色谱筛选水解活性不同，该方法是定量的。 （2）所有反应和分析均在微孔板的小孔中进行，无需气相色谱、高效液相色谱、核磁共振工作和分析。 (3)该方法仅需要千分之一到百分之一的底物和水解酶。(4)该方法可以检测任何种类的酯的水解，而不仅仅是显色酯。
该方法的缺点：（1）灵敏度低； (2) 需要明确的解决方案； (3)反应过程中需要产生或消耗质子。 基于紫外可见分光光度计的高通量检测方法。 利用可见光和紫外光的吸收来测试具有光吸收特性的物质的浓度。 底物和产物的光吸收特性的差异用于确定反应混合物中底物的还原或产物的量。 增加量以确定酶活性。 该技术相对成熟，广泛应用于高通量酶活性筛选。 尤其是检测仪器经过改进后，检测的灵敏度和速度都得到了很大的提高，成为高通量筛选最便捷的检测方法之一。 当底物或产物着色或吸收紫外区的光时，吸光度法可以非常快速、方便地进行，因为可以使用分光光度计跟踪和检测吸收产物的出现或消失速率。 基于紫外光和可见光的检测方法可以对微量滴定板进行目视预筛选。 检测的关键在于筛选反应体系中含有能吸收特定波长光的物质，这些物质能灵敏地反映筛选结果。 如果酶促反应会产生可靠的紫外/可见光信号，则可以使用紫外/可见光读板仪筛选 NADH 转移到丙酮酸以产生乳酸和 NAD（还原型辅酶）的孔中。微量滴定板。 吸收，而氧化型 NAD、乳酸和丙酮酸则没有，因此跟踪并监测 340nm 处光吸收的减少。 脂肪酶催化对硝基苯酯水解生成对硝基苯酚酯，在405nm处有较强的紫外和可见光吸收。 反应在微量滴定板上进行。 由于 (s)-底物和 (r)-底物的 UV 吸收不同，可以筛选具有对映选择性的脂肪酶变体。
该方法需要内在的发色团。 NBT（硝基蓝四唑）/PMS（吩嗪硫酸甲酯）系统已成功用于脱氢酶的高通量筛选。 反应原理如下：NTB被还原为在可见光区域有吸收的甲臜染料，在滤纸或标准96孔板读数器上可以很容易地观察到颜色增强。 蓝紫色甲臜在 555 nm 处有最大吸收。 当底物和产物均无特征光吸收峰时，仍可采用吸光度法追踪酶反应。 在这种情况下，该反应与其他酶促反应耦合，可以轻松地通过光度测定进行测量。 丙酮酸激酶催化磷酸烯醇丙酮酸和ADP之间的反应。 磷酸烯醇丙酮酸 + ADP = 丙酮酸 + ATP。 当反应体系中加入大量过量的乳酸脱氢酶和NADH时，每一分子丙酮酸生成并还原时，一分子NADH被氧化转化为NAD+，导致340nm处的光吸收减少。 为了测定磷酸酶、糖苷酶和其他一些水解酶活性，将无色硝基苯化合物和酶混合并在微碱性条件下孵育生成硝基苯酚，产生400至420nm之间的硝基苯酚。 特征峰。 反应如下： 硝基苯酚 + OH 硝基苯酚盐 对于没有固有发色团的底物，可以设计酶联紫外和可见光酶活性检测。 也就是说，酶促反应的产物可以被另一种酶转化为可以产生光谱信号的次级产物。 例如，检测催化手性乙酸水解酶的活性，其检测原理是通过一系列偶联酶促反应，将手性乙酸水解产生的乙酸按照化学计量关系转化为NADH，然后将其吸收，即可可以很容易地通过标准板读数器在微量滴定板的孔中进行测量。
该方法每天可检测大约 13,000 个样本。 HRP/ABTS/H2O2 测定是一种通过将过氧化氢的产生与辣根过氧-(乙基苯噻唑啉)-6-磺酸H2O2 反应耦合来检测半乳糖氧化酶活性的方法。 HRP 酶催化 ABTS 聚合，产生绿色可溶性重产物，可通过分光光度计在 405 nm 处检测到。 ABTS在水溶液中溶解度高、消光系数高、重现性好。 该方法适用于96孔板检测。 半乳糖氧化酶可以氧化初级酶，生成醛和过氧化氢。 这种酶催化氧化是一种绿色生产方法，不污染环境。 然而，伯醇的化学氧化方法需要使用对环境有害的重金属和有机溶剂。 ，另外半乳丙酮酸+NADH+H乳酸+NAD宋连明等：生物催化剂的高通量筛选方法51糖氧化酶具有广泛的底物特异性和严格的区域选择性和立体选择性，广泛应用于化学合成。 酶免疫分析能够基于紫外线和可见光对对映选择性催化剂进行高通量筛选。 通过使用可以与对映体结合的抗体，可以检测反射产物的浓度。 该方法几乎适用于所有化合物。 每天可测量100个样品，设备简单。 该方法测量快速、简便，专属性强。 自动扫描分光光度计快速、准确、自动化，适用于酶活性测定和酶反应研究工作。
荧光检测荧光检测方法具有灵敏度高、方法简单等优点，广泛应用于高通量筛选。 该方法可以使用非常稀的底物浓度和非常少量的催化剂进行检测。 荧光检测方法的关键在于荧光物质的标记和荧光物质的获取。 荧光检测方法有两种：一种是将荧光（或潜在活性）基团共价连接到目标底物上；另一种是将荧光基团共价连接到目标底物上。 另一种是使用荧光传感器，酶催化反应目标后产生信号。 例如，使用伞形酮作为内置荧光团可用于几种不同类型的酶促反应。 其反应原理是通过两个偶联的顺序酶将酶促反应产物转化为荧光产物，通过测量荧光来测定酶的活性。 荧光测量可以在标准微量滴定板的孔中进行。 使用 NAD(P)H 的荧光检测可用于筛选使用 NADH NADPH 作为辅因子的氧化还原酶。 NAD(P)H在强碱性条件下不稳定，会分解形成强荧光物质。 微量滴定板可用于高通量筛选。 近年来，对可持续工艺的需求推动了生物催化剂在工业中的应用。 自20世纪生物催化引入化学工业以来，生物催化技术就被视为极其重要，对于传统生物发酵和化学工业的改造非常重要。 有吸引力的技术之一，向精细化工、大宗化学品、能源、材料等领域的渗透日益明显，将承担起实现绿色生物制造、有效解决资源和环境问题的重要责任。
同时，生物催化技术的成功应用也产生了显着的经济效益和社会效益。 为了确定某种化学转化的生物催化剂，需要引入足够量的优质生物多样性进行筛选。 生物催化剂的筛选越来越受到学术界和工业界的关注。 酶制剂技术[M]． 化学工业出版社，2008 年。 [3] 、S. 、 等人。 孙志浩、徐建河译. 生物兴奋的翻译。 生物催化剂与酶工程[M]． 科学出版社，2008，[5]张玉斌。 生物催化手性合成[M]． 化学工业出版社，2002年。张彩英主编。 酶工程[M]． 化学工业出版社，2008．[7]孙志浩． 生物催化技术[M]． 化学工业出版社，2005．[8]杜冠华． 高通量药物筛选[M]． 化学工业出版社，2002． [9]李荣秀，李平作。 酶工程药物[M]． 化学工业出版社，2004．[10]林章林，李爽译． 工业酶制剂及其应用[M]． 化学工业出版社，2005。（上接）第43章生成研究进展国际上，NOX生成机理及其控制研究已积极开展了20多年。 然而，目前对燃烧过程中NOX生成的研究仍主要基于实验，尚未形成完整的理论。 特别是在煤粉燃烧领域，主要通过具体的工艺流程