工程化P450 TamI作为迭代生物催化剂选择性催化C-H官能化和环氧化生成替达霉素类抗生素
标题：P450 TamI 作为晚期 C−H 和
期刊：ACS
年份：2021
影响因子：13.7
作者：Rosa V. 、、S. Wald、Jin Yi Tan、A.、Yogan、Sean A. 、J. 、Marc -、John、KN Houk 和 David H.
作者单位：of Los
概括
P450酶是一类强大的生物催化剂，能选择性氧化复杂天然产物的C−H键，广泛应用于酶级联反应。近期报道了一种多功能细菌P450 TamI的结构，并分析了其与底物结合的分子机制和在底物不同碳原子上的严格反应顺序。本研究通过在TamI的、和位点设计相应的突变体，改变了催化反应中的天然选择性和步骤顺序，同时设计了一个突变体TamI，其无需氧化伙伴TamL的帮助，就能催化四步氧化反应生成泰达霉素B。通过TamI介导的酶反应合成了五种具有生物活性的泰达霉素衍生物。量子力学计算和MD模拟为迭代P450 TamI酶催化选择性的变化和增强的连续氧化能力提供了机理分析。
研究内容
1. 具有不同选择性的 TamI 突变体的鉴定和设计
据报道，细胞色素P450 TamI酶可以在底物的不同碳原子上催化3个高选择性的顺序氧化反应，生成产物（5）（图1）。对于TamI关键位点突变，根据突变体催化反应产物的分析发现，TamI L244A突变体形成了少量新的二氧化同源物（11）（图2A，泳道8）；TamI L101A生成了一个未知的单氧化同源物（6）和两个新的二氧化同源物（7）和（8）（图2A，泳道7）；TamI L295V优先形成产物（7）（图2A，泳道10），而TamI L295A则选择性地形成产物（9）和（10）。
图 1 P450 TamI 催化的迭代氧化反应。在步骤 1 中，TamI 催化 1 中 C10 的羟基化；在步骤 2 中，黄素蛋白 TamL 将 2 的 C10 羟基氧化为酮。在步骤 3 中，TamI 将 3 的 C11/12 环氧化；在步骤 4 中，TamI 将 4 的 C18 羟基化，得到最终产物 5。
图 2 TamI 突变体的终点分析。
(A) 选定反应的 LC-MS 分析。标准品包括 (1)-(5)（1-5 泳道）。化合物 2-5 由于异构化而显示姊妹峰。新的泰达霉素同源物标有星号（7-9 泳道）。(B) 野生型和突变型 TamI 与 1 的体外酶促反应
2. 设计具有更强迭代能力的Taml突变体
早期研究表明，黄素氧化酶TamL是（2）转化为（3）的关键因素（图1，步骤2）。本研究设计了一种不需要TamL的TamI突变体，通过四步氧化反应直接从（1）生成（5）。可以看出，空间位阻较小的氨基酸取代可以削弱底物在活性位点的构象限制，有利于与较高氧化态的泰达霉素中间体结合，从而实现在没有黄素蛋白TamL的情况下底物的持续氧化。
3. TamI和L295A直接催化步骤3生成泰达霉素L（6）
与天然反应的第一步不同，C10处的羟基化，TamI和L295A直接催化（1）的C11/12环氧化（图3），生成新的氧化同源物泰达霉素L（6），表明TamI的逐步氧化反应被打破。密度泛函理论（DFT）计算了从1开始的C10羟基化、C11/12（R/S）环氧化、C18羟基化的转变能垒，结果表明烯烃环氧化的能量最高（2.6 kcal/mol）。这表明TamI和L295A中蛋白质构象的变化对于催化难以发生的反应具有重要意义。同时，分析了TamI和WT与（1）的MD模拟，结果表明存在两种主要的底物结合构象。 第一种构象与 WT 相似，C10 氢具有适合 C-H 氧化反应的几何结构。第二种构象更有利于烯烃环氧化反应（图 4A）。此外，TamI L295A (1) 的 MD 模拟结果表明，C11 原子与血红素中心的接近度在大部分模拟过程中保持不变，与 C11/12 环氧化一致。这些结果表明，底物周围的疏水相互作用是将 TamI 中的氧化途径从烯丙基 C-H 氧化转换为环氧化的关键因素。
图 3 TamI 突变体催化产生具有不同选择性的新型泰达霉素同源物。TamI 催化四步氧化级联反应。新代谢物包括泰达霉素 L (6)、M (7)、N (8)、O (9) 和 O′ (10)
图 4 TamI 的计算分析。TamI 突变体与底物的两种结合模式使 C11/12 环氧化（步骤 3）和 C10 羟基化（步骤 1）之间产生竞争。第二种结合姿势（蓝色）促进环氧化反应，支持了实验结果。
4. TamI L295V 催化步骤 1 和 3（省略步骤 2），生成泰达霉素 M (7)
与 WT 催化的反应类似，TamI L295V 首先催化 (1) 形成 (2)。然而，该突变体可以直接催化 (2) 产生双氧同源物泰达霉素 M (7)（图 3）。使用 TamI L295V 和 (2) 进行的 MD 模拟表明，在初始最小化后实现了较低的能量构象，其中 C11 最接近其他反应位置和氧化铁，这与 C11/12 环氧化一致。此外，在 sp. 307-9 ΔtamL 黄素蛋白突变体的培养基中检测到 (2) 和 (7) 的产生。我们推断 TamI WT 也能够在没有黄素蛋白的情况下催化 (2) 环氧化为 (7)，这一假设得到了以下观察结果的支持：当 (2) 被纯化的 TamI WT 催化时会产生微量的 (7)。
5. TamI 催化步骤 3 和 4，生成霉素 N (8)
在催化 (1) 生成中间体 (6) 后，TamI 催化 (6) 生成双氧化同系物泰达霉素 N (8)。C18 处的电负性羟基部分降低了相邻质子周围的电子云密度，并将 C18 的化学位移增加至 58.9 ppm，而缺乏此特性的泰达霉素同系物中观察到的典型化学位移为 15-16 ppm。进行了 DFT 计算以确定 (6) 中 C18 和 C10 处羟基化的跃迁势垒。C10 (S) 和 C18 处的羟基化反应势垒基本没有能量差异，前者较低（图 5）。这与实验观察到的 TamI 区域选择性相矛盾。 虽然 (8) 完全由 (6) 生成，但使用突变体和 (6) 进行的 MD 模拟表明，在整个模拟过程中，C18 最接近血红素铁氧化位置，与步骤 4 一致。将 MD 模拟的 Oheme−C18 氢距离和 Oheme–C18H-C18 二面体几何与 QM 计算的理想过渡态进行了比较。这表明 TamI 活性位点的几何形状有利于 C18 羟基化。
图 5 TamI 区域选择性的 DFT 计算。以 (6) 为底物，C10 和 C18 上的 C−H 氧化反应的内能
综上所述
TamI的研究为多功能P450酶对复杂化合物的不同选择性氧化机制提供了新的见解。TamI活性位点的、和的突变可以实现催化剂控制的迭代氧化级联反应。此外，TamI可以选择性氧化C18甲基位点，逆转烯烃和烯丙基C−H键之间的位点选择性，以及氧化非烯丙基活化的C−H键。这一特性使我们能够酶促合成新的泰多霉素并进一步探索其抗寄生虫活性。该研究为蛋白质工程化P450同源物以催化多步氧化反应提供了参考。
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结尾