发酵原料：基础培养基和补料培养基的成分以及补料策略
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优化细胞培养中基础培养基和补料培养基的组成以及补料策略是上游工艺开发的关键组成部分，具有显著提高生产效率的潜力。此外，为了支持从高活细胞密度和Qp转化为高表达滴度，培养基的开发和选择还需要考虑一些其他工艺因素。这些工艺因素包括培养工艺性能、简单性和稳健性、产品质量和表达、与下游工艺的兼容性、法规等。细胞培养基和补料的开发非常适合DOE方法，因为有许多相互作用的变量，它们的组合可以导致更高的细胞生产效率，而DOE可以实现对这些变量的更科学的研究。
一
国内细胞培养能力
目前，国内大分子生产能力快速增长，带来大量培养基需求。
国内部分企业产能汇总
此外，这些企业的产能还在建设中，预计未来国内产能高峰时将达到100万升，这将导致培养基的使用量大幅增加，尤其是在行业越来越青睐连续流生产的情况下，将消耗更多的培养基。高峰时，CHO细胞培养的培养基消耗量预计将达到2000万升左右。
二
基础培养基
在抗体产品的生产中，使用无血清培养基已成为标准，CD培养基的使用正在增加。老一代的商业化工艺可能仍会使用血清或水解物，但新一代CHO培养基已不再使用血清和水解物，以避免因血清来源而受到外源因素污染的风险以及水解物造成的批次间变异性。有多种市售的培养基配方可以支持抗体在生产中的使用。该行业现在专注于为当今生物制药行业常用的各种CHO细胞系设计、开发和营销特定的培养基。每种培养基的表现可能都不同，因此基础培养基通常通过比较其维持细胞生长和生产产品的能力来筛选。通常，商业配方的组合可以提供更高的生产效率。将候选克隆和基础培养基的筛选整合起来可以变得更加高效，节省大量工艺开发时间，并实现更高的生产效率和产量。
2.1
能量源
哺乳动物细胞使用葡萄糖和谷氨酰胺作为其首选能量来源。杂交瘤细胞和产生重组抗体的细胞系通常以 1-10 pmol/细胞*天的速率使用葡萄糖。在没有葡萄糖或某些替代糖（如果糖）的情况下，哺乳动物细胞不会生长。
葡萄糖通过糖酵解产生乳酸，在培养初期积累于生物反应器中，虽然乳酸在细胞培养后期可被细胞利用，但过多的乳酸积累会抑制细胞生长和单克隆抗体的产生。乳酸水平可以通过多种方式控制，例如通过添加营养物，甚至可以使乳酸代谢从乳酸净生产转变为乳酸净消耗。乳酸脱氢酶（LDH）催化丙酮酸转化为乳酸。
有报道指出，在LDH和丙酮酸脱氢酶激酶表达下调的CHO细胞中，乳酸产量下降90%，比生产率提高75%，单位体积抗体产量提高68%，而对细胞生长没有明显影响。（但我认为这种方法可能具有很大的偶然性或个体性。）更好地了解低产和高产细胞系的代谢特征和调控机制将有助于开发高产细胞培养工艺。
谷氨酰胺经常与葡萄糖一起使用，以支持细胞生长并帮助维持哺乳动物细胞培养中的细胞活力。杂交瘤细胞使用1-5 pmol/细胞*天的谷氨酰胺。CHO细胞的谷氨酰胺依赖性低于杂交瘤或小鼠骨髓瘤细胞，因此可以在培养基中添加较少的谷氨酰胺以维持生长。最近对CHO细胞的代谢分析发现，谷氨酰胺是呼吸所必需的。它比葡萄糖更有效地利用，并且在指数生长期对乳酸的产生贡献更大。谷氨酰胺的代谢产生氨，氨在培养基中积累，抑制细胞生长和产物产生，并且可以使末端糖链唾液酸化。培养基中葡萄糖和谷氨酰胺的浓度也影响唾液酸化水平。低浓度（葡萄糖或谷氨酰胺）会降低产物的唾液酸化水平。据报道，添加某些氨基酸，如苏氨酸、脯氨酸和甘氨酸，可以减轻氨的毒性作用。
葡萄糖和谷氨酰胺的负面影响可以通过适当的补料策略来最小化，补料策略可以通过控制营养水平和重新定向细胞代谢来最大限度地减少乳酸和氨的产生。在分批培养方法中，增加了生物反应器中的细胞数量和mAb浓度。
2.2
氨基酸
蛋白质是哺乳动物细胞中最丰富的成分，约占细胞重量的18%。转染细胞产生单克隆抗体时，还需承担合成异源蛋白质的额外负担，这需要大量相应的氨基酸结构单元。
哺乳动物细胞无法合成某些必需氨基酸，必须将这些氨基酸添加到培养基中才能维持细胞生长。
虽然细胞可以合成非必需氨基酸，但它们还是被常规地添加到培养基中，添加这些氨基酸可以减少细胞的能量需求，因为细胞不需要合成氨基酸，可以将多余的能量转移到单克隆抗体的生产中。
谷氨酰胺是细胞培养中能量产生和蛋白质及核酸合成的必需营养元素。然而在细胞培养基中，谷氨酰胺很不稳定，会自发降解产生副产物氨和吡咯烷酮羧酸。因此，谷氨酰胺通常以二肽的形式提供，二肽要稳定得多。在CHO-GS细胞系的培养基中添加谷氨酰胺和天冬酰胺，可以有效缓冲培养基，减少乳酸产生，维持细胞培养相对稳定，提高细胞存活率，提高抗体生产效率。酪氨酸难溶于水溶液，易沉淀，如果缺少这种氨基酸，细胞在表达单克隆抗体时会引入不必要的酪氨酸序列变异。因此需要另一种氨基酸来代替酪氨酸。添加含有酪氨酸的二肽元素，可以维持培养基中氨基酸的高浓度，从而防止营养限制，减少产品不必要的一级结构变化。 苏氨酸、脯氨酸和甘氨酸等几种氨基酸具有保护作用，可抵御饥饿、高渗透压、高 CO2 或氨等应激条件。这些应激条件在长期批量培养、高产量或高细胞密度培养过程中经常遇到。
2.3
酯类
脂质是所有细胞膜的必需结构元素，维持细胞增殖、生长和存活。脂质占哺乳动物细胞重量的5%。60%的脂质是磷脂，是细胞膜中最丰富的成分。在整个CHO细胞中，三种主要脂质是磷脂（30 fmol/细胞）、胆固醇（10.8 fmol/细胞）和鞘磷脂（1.9 fmol/细胞）。细胞膜含有49%的总磷脂、64%的胆固醇和69%的鞘磷脂。从乙醇胺和脂肪酸开始，哺乳动物细胞可以合成磷脂酰乙醇胺，其他磷脂由此衍生。虽然哺乳动物生长需要两种必需脂肪酸，亚油酸和α-亚油酸，但这种要求似乎并不适用于哺乳动物细胞培养。 然而，这些脂肪酸以及硫辛酸和某些磷脂（如磷脂酰胆碱）通常包含在基础培养基配方中。一些细胞系无法合成某些脂质，需要将它们包含在培养基中才能生长。一个例子是小鼠骨髓瘤细胞系 NS0 需要胆固醇，该细胞系缺少胆固醇合成途径中的一种酶。在细胞培养物中添加非必需磷脂、脂肪酸和固醇可以降低细胞的生物合成要求。细胞对脂质补充的反应不同，但细胞生长和 mAb 生产的改善很常见。脂质通常作为分批培养中饲料的一部分添加。如果使用一次性反应器生产 mAb 产品，需要考虑的一点是，添加的脂质可能会粘附在生物反应器表面，细胞难以利用。 为了解决这个问题，在扩大规模之前，需要在小型一次性反应器中研究脂质补充和生物反应器集成。脂质不溶于水，在添加到培养基中时需要分散剂。除了传统的载体血清提取物和牛血清白蛋白外，脂质分散技术还包括乳液、胶束和脂质体。在无血清培养基中，环糊精是一种成功使用的分散剂。它是吡喃糖葡萄糖的环状聚合物，可以有效增加脂质溶解度。环糊精具有双重功能：它们有效地溶解脂质并通过分子包封将它们保持在培养基中。
需要针对特定的细胞系确定培养基中环糊精的最佳浓度及其与胆固醇-脂质的比例，特别是在一次性生物反应器中培养细胞时。培养基中载体甲基-β-环糊精和线性低密度聚乙烯薄膜的存在足以抑制胆固醇依赖性NS0细胞的生长。通过减少加入培养基中的过量环糊精，细胞开始利用胆固醇-环糊精复合物作为外源胆固醇的唯一来源。他们提出的生长抑制机制是培养基中过量的环糊精会从细胞膜中提取胆固醇，然后不可逆地吸附或包封胆固醇-环糊精复合物在Wave反应器的线性低密度聚乙烯表面。
2.4
无机离子
哺乳动物细胞对无机离子的需求量不等，最高可达细胞总重量的1%。这些离子通常以足够的量加入到基础培养基中，以至于它们在分批培养中通常不是限速因素，但在高密度培养中它们会变得更加有效，可能成为细胞培养中的限速因素。大量文献报道无机离子对抗体的表达率有显著的影响。无机离子在培养基中一般以六种相对浓度水平存在：
（1）非常高的浓度（g/L），例如氯化钠，用于调节培养基的渗透压，碳酸氢钠，用于控制培养基的pH值；
（2）高浓度（10-100g/L），包括钙、锂、镁、钾和磷酸盐；
（3）低浓度（约几百毫克/升），包括铁盐、锌盐；
（4）浓度极低（几十毫克/升），如铝、钡、钴、铬、铜、氯化物、硒、钛的盐；
（5）浓度极低（小于1ug/L），如银、锗、溴、碘、锰、钼、钒、镍和锡的盐。这些无机盐通常用作基础培养基和/或补料培养基。磷是核酸、磷脂和其他细胞成分的结构成分。有证据表明，在某些细胞浓度较高的培养物中，添加磷酸盐可以增加细胞和单克隆抗体的产生。铁可以用柠檬酸盐或EDTA作为螯合物提供，从而无需转铁蛋白（一种铁转运蛋白）。硒也可用作批量培养和摇动培养中的高效铁载体。在烧瓶培养中可以实现单克隆抗体的高密度（>10 x 106细胞/mL）和高表达滴度（约3g/L）。 在无蛋白培养基中添加锌离子可以完全替代一些杂交瘤细胞，如NS0和CHO细胞对于添加重组胰岛素的要求，支持良好的细胞生长和单克隆抗体的表达。
2.5
维生素
哺乳动物细胞需要维生素才能生长，大多数培养基配方都含有足量的维生素。在典型的高密度生长条件下，维生素通常不会限制生长速度。维生素通常作为浓缩饲料添加到培养基中。提高生产力。然而，据报道，维生素浓度超过正常水平的 35% 会限制 CHO 细胞系的生长。
2.6
补充剂
动物血清是研究实验室或生产细胞系开发早期常用的补充剂，但出于监管和安全方面的考虑，血清的使用已大大减少或停止，即使在开发的早期阶段也是如此。血清是直接或间接刺激细胞生长或具有保护作用的物质、激素、蛋白质和许多其他因子，为哺乳动物细胞提供了极好的生长和培养材料。然而，对于临床和商业生产而言，使用动物源性血清存在实际和监管问题，包括血清质量和促进细胞生长的能力不稳定，以及可能被BSE和其他动物病毒污染。由于这些问题，监管机构已发布指导意见，旨在对生物制药生产任何阶段使用动物血清进行监管，并且实际上已不鼓励使用。
血清可以用胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和硒等补充剂组合代替，这些补充剂最常用于无血清配方。来自动物、酵母或植物来源的蛋白质水解物也可用作基础培养基，然而，对 BSE 和其他污染病毒的担忧也适用于这些动物来源的水解物和蛋白质，甚至植物来源的水解物也已被证明含有可在 CHO 细胞或其他细胞中增殖的病毒。因此，目前的趋势是完全化学定义的培养基，虽然从监管和安全角度来看是可以接受的，但对哺乳动物细胞来说，这带来了更具挑战性的生长环境。
鉴于该行业在处理包括细胞培养基在内的受污染原材料方面的经验，监管机构显然要求制定新的程序以确保供应链所有组成部分的安全，而企业也已开始实施这些程序以降低制造过程中产品污染的风险。这些程序包括对原材料管理和测试的修订、风险评估以及对可灭活原材料中病毒的技术的评估，例如紫外线处理和伽马射线照射，有时还包括用于过程控制的核酸测试。如果需要在培养基中添加胰岛素、转铁蛋白和白蛋白等蛋白质，则最好使用重组来源而不是动物来源。使用无蛋白培养基和无蛋白配方可以减少不需要的蛋白质的添加。这些蛋白质可能会影响下游纯化过程，并可能在最终纯化产品中以少量存在。许多无血清和无蛋白培养基以粉末或液体形式在市场上有售，包括浓缩物。市售或定制的补充剂可以提供浓缩的营养物质和生长因子，可用于批量培养过程中的饲料添加。
2.7
其他添加剂
据报道，在培养基中添加某些化合物，如丙酸钠和丁酸钠，可以提高杂交瘤和CHO细胞中的产品产量。虽然其机制尚不完全清楚，但似乎与基因可及性的提高有关。最近，金三羧酸作为转铁蛋白的合成替代品被加入，发现它在CHO细胞中起胰岛素样生长刺激因子的作用，可用于某些生产工艺。己酸羟肟酸已被证明可以使CHO细胞中单克隆抗体的产量增加40％。据报道，戊酸可以增加CHO细胞培养中的蛋白质产量。丙戊酸（VPA，2-丙基戊酸）是组蛋白去乙酰化酶的支链羧酸抑制剂。当加入培养基中时，发现在稳定表达单克隆抗体的三株CHO细胞系中的两株中，单克隆抗体的表达滴度可以增加。一株是强烈增加，另一株是中度增加。 细胞培养基中通常会添加表面活性剂（例如 Tween 80 和 F-68），以保护细胞免受生物反应器中搅拌和起泡引起的表面气泡破裂所造成的剪切力和流体动力学的影响。细胞培养工艺开发涉及测试各种市售或定制的培养基配方，包括部分或全部添加剂以及补料培养基和补料策略，以确定特定生产细胞系的最佳工艺。即使是具有共同来源的克隆细胞系在培养中也可能表现不同，这主要是因为转基因的未知表观遗传效应或转基因整合的影响。因此，通常基于亲本细胞系开发的平台工艺并不适用。特定工艺开发通常会产生更好的工艺。
三
饲料发展战略
采用补料分批培养可防止重要培养基成分的消耗，从而延长细胞培养时间和细胞产品的产量。有许多市售的补料配方可用于CHO细胞和其他生产细胞系。补料开发涉及对消耗的培养基的分析，计算出氨基酸和维生素等营养物质的特定消耗率，并制备浓缩营养培养基，使每对营养物质的比例等于它们的特定消耗率。其理念是通过补料使消耗的营养物质恢复到其基础水平，从而使所有营养物质恢复到其基础水平。目前大规模哺乳动物细胞培养的行业实践通常是使用标准平台的批量培养过程，以固定体积、大剂量定期补料。最近在补料策略开发方面的工作涉及自动监控和动态补料，以及使用算法来改变补料速率。Lu 等人。 描述了一种简单的批量培养优化策略，补料培养基的开发基于对废培养基的分析，并建立补料策略，在离线监测培养基中相关营养物质的浓度后使用特定量的补料。间歇添加不同体积的补料培养基。