凯氏定氮法测定黄豆的粗蛋白含量
概括:
凯氏定氮法测定大豆中粗蛋白含量
1. 原理
将食品样品加热,在硫酸和催化剂的作用下消化,使蛋白质分解,其中C和H形成CO2和H2O逸出,而氮则以氨的形式与硫酸反应生成硫酸铵并残留在酸液中。消化液再经碱化、蒸馏,使氨游离,氨随水蒸气蒸发,被硼酸吸收。生成的硼酸铵用标准盐酸溶液滴定,由消耗的盐酸标准溶液计算出总氮含量,再换算成粗蛋白含量。
2NH2-(CH2)2-COOH + →(NH4)2 SO4 + 6CO2+ 12SO2 + 16H2O
(NH4)2SO4 + 2NaOH→2NH3++ 2H2O
2NH3 +→(NH4)2B4O7 + 5H2O
(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O → +
2. 仪器和试剂
1. 100mL 凯氏烧瓶
2.微量凯氏定氮仪
3. 试剂
硫酸铜 硫酸钾 硫酸 2%硼酸溶液
混合指示剂:0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%甲基蓝乙醇溶液,按2:1比例混合后使用。或0.1%甲基红乙醇溶液与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液,按1:5比例混合后使用。
20%NaOH溶液 0.01mol/L HCl标准溶液
3. 测定方法
1. 样品消解:
准确称取约0.3g均匀粉碎的黄豆粉,小心转入干燥的凯氏烧瓶中(不要让其粘附在瓶壁上),加入0.10mL浓硫酸,在烧瓶口插入合适口径的干燥管,用带软管的液压真空管连接,利用液压动力抽出消解过程中产生的烟雾。先用小火慢慢加热,待内容物完全炭化、泡沫消失后再加大热度,消解至溶液透明呈蓝绿色为止。撤去排气管,继续加热0.5h,冷却至室温。
取20mL蒸馏水,缓慢加入容量瓶中,待样品冷却至室温后,转移至100mL容量瓶中,用蒸馏水冲洗容量瓶数次,加入容量瓶中,旋涡混匀,放冷,再用蒸馏水定容备用。
同时进行空白消化。
2、蒸馏和吸收:
1> 按照蒸馏装置图安装好装置,打开所有夹子。拔掉进样口处的接地插头,从进样口处加入50mL蒸馏水,再插上电源插头。将冷凝管与冷凝器连接好。
2>在蒸汽发生瓶中加入蒸馏水至其容积的三分之二,加入几粒沸石和4滴甲基橙,再加入3mL浓硫酸,然后放在电炉上加热使水沸腾。
3> 产生蒸汽后,夹紧夹钳1,使蒸汽通过导管进入反应管外套管内。蒸汽从废液排液口排出后,夹紧夹钳3,使蒸汽进入反应管内蒸馏洗涤10分钟。打开夹钳1,同时夹紧夹钳2。反应管内水全部排入外套管内后,打开夹钳3,排出废水。立即从加液口加入约20mL蒸馏水,立即再次夹紧夹钳3,等待水排出。重复操作3次,洗涤完毕。
4>打开所有夹钳,从进样口吸取10mL试样溶液(或空白溶液)加入到反应管中,塞上磨口塞。量取2%硼酸25mL置于250mL锥形瓶中,再将吸收液置于冷凝管下端,冷凝管下端应插入液面以下。再从进样口加入约%NaOH溶液,使反应管中试样溶液有黑色沉淀或变为深蓝色,用少量水冲洗进样口,塞上磨口塞,用少量水封好。
5>夹紧夹钳1,使蒸汽经导管进入反应管外套管内。待蒸汽从废液排出口排出后,夹紧夹钳3,使蒸汽进入反应管内。开始蒸馏。待吸收液变蓝后,计时蒸馏10分钟,提起冷凝管下端离开吸收液面,再蒸馏1分钟。用萘氏试剂检查无氨后,停止接收馏出液。打开夹钳1,同时夹紧夹钳2。待反应管内样品废液全部排入外套管内后,打开夹钳3,排出废液。立即从进样口加入约20mL蒸馏水,立即再次夹紧夹钳3,待水排出后,重复操作洗涤3次,然后进行样品的平行测定。测定完毕,打开所有夹钳,停止加热,待冷却后,取出装置洗涤。
3.滴定:
用0.01 mol/L HCl滴定吸收液,至呈红色为终点,记录所消耗的HCl体积。
4.计算:
蛋白质 % =
C—HCl标准溶液浓度mol/L
V1 — 滴定样品吸收溶液所消耗的 HCl 标准溶液的体积 mL
V2——滴定样品空白溶液所消耗的HCl标准溶液的体积,mL
m — 大豆粉质量 g
F — 大豆蛋白质含量换算系数 5.71