近年来，生物催化已成为合成化合物的重要途径，常用于工业规模生产。 为了应对工业经济对生物催化反应的严格要求，相关研究团队在提高反应时空产率、底物转化率和产物浓度等方面做出了许多努力。
由于酶在水性系统中往往更稳定，因此通常选择水性介质作为酶促反应的溶剂。 然而，常见工业化合物的水溶性通常很差。 如果使用水溶液，会导致底物负载量低，生产效率降低。 同时，有些合成反应需要酶法和化学方法相结合，有些化学催化剂只能在非水溶液中使用。 用于媒体。 这就给溶剂体系的选择带来了矛盾和困难。
近日，一篇入选《2021 Green Hot》的关于生物催化反应溶剂体系选择的综述文章进入了我们的视野。 该综述对等生物催化领域的公司有很大帮助。 教授和同事分析了不同溶剂体系的优势和挑战，进一步选择了适合不同体系的“非常规介质”。 最后，他们还制作了流程图，以便有合成需求的团队可以根据自己的需求快速找到合适的溶剂体系。 其中，来自的Marco博士也是这篇综述的作者之一。
1.生物催化反应的不同溶剂体系
本综述根据水与其他溶剂的比例不同，将体系分为水性单相（纯水相/共溶剂体系）、两相（双相/水-基质体系）和非水性单相。溶剂系统。 相体系分为三类（微水反应体系/纯底物体系）。 系统具体组成见下图（原图1）。
图1 不同溶液体系的相对含水量
1.1 水单相溶剂体系
水性溶剂或缓冲溶液由于其性质温和且易于获得而被认为是最简单的方法。 可以是纯水相，也可以在水溶剂中加入适量的与水混溶的助溶剂，以增加反应试剂的溶解度（助溶剂也可以参与反应，如辅因子再生）。
1）反应条件温和，酶性质（稳定性、活性、选择性等）稳定；
2）双相系统不存在常见的中间相问题，如传质困难、中间相蛋白质失活等。
1）对于水溶性较差的常见工业化合物，纯水相体系底物负载量低，更适合不需要高产品浓度的高价值产品；
2）此类系统容易产生大量废水，并且产生的产物的提取和分离很困难，这可能需要在下游处理过程（DSP）中增加额外的能源/资源支出。
☆实例：在利用醛肟脱水酶合成脂肪腈时，添加10%乙醇作为共溶剂，1.4kg/L的底物转化率成功达到93%，远远优于纯水相体系和双相体系系统。
参考文献：A.、S.、M. Worm 和 H.Gröger。 浓度高达 1.4 kg/L：Heme J. Org.Chem., 2019, 84,4867–4872。
1.2 两相溶剂体系
两相溶剂体系主要由两相组成——水相和有机相（与水不混溶）。 底物溶解在有机相中，酶存在于水相中。 在高浓度底物不损害酶的情况下，底物可以直接作为另一个“有机相”出现，即“水-底物”系统（-纯）。
☆举例：由于参与反应的两种酶也可能催化CHMO（环己酮单氧化酶）的反应，Amin的团队决定选择双相体系作为己内酯合成的溶剂体系。 选择十二烷作为溶剂，将水相中的产物浓度从20mM提高到53mM。
参考文献：A.、R. Hatti-Kaul、F. 和 S. Kara。 A Bi- 代表 ε- 1,6- 作为“-”。 ，2015年，7，2442–2445。
1.3 非水单相溶剂体系——MARS
MARS，微水反应体系（micro-）的缩写，主要由非水溶剂（如疏水性有机溶剂）组成，只含有饱和量的水，形成水合膜包裹生物催化剂，维持酶的活性活动。
1）更高的基板承载能力；
2）含水量低，适用于需要避免水的反应，如反应试剂的水解；
3）不存在中间相问题；
4）废水产生量少，DSP处理更简单，溶剂回收方便。
1）可能存在酶不稳定的问题（但是，在某些情况下，该系统可以提高酶的稳定性）。
☆示例：在1-苯基-1,2-丙二醇的合成路线中，团队采用MARS系统替代单一水相，将底物浓度从26mM提高到440mM，最终产物浓度是原法的1600倍水相。 。
参考文献：A. 和D.. 微量的两步：使用高量的二醇。 绿色化学, 2014, 16, 3472–3482。
1.4 非水单相溶剂体系-纯底物
另一种非水单相溶剂体系是纯底物体系，即没有其他溶剂，酶分散在底物中，其中可能含有少量的水以维持酶的稳定性。 这要求基材本身处于液态。
1）四个系统中，底物负载量最高，相应的产物浓度也最高；
2）与MARS的优点类似，DSP处理简单，不存在中间阶段问题。
1）可能存在酶不稳定问题；
2）很难实现完全转换。
☆示例：酶竞赛团队进化出用于合成R-苯乙胺的转氨酶，并在此路线上尝试了多种溶剂体系。 我们发现一个有趣的现象，即随着溶剂体系中水含量的降低和底物负载量的增加，酶的相对活性的变化不是线性的，而是水单相>纯底物>双相，如下所示如图（原图2）所示。
图2 不同溶液体系中对苯乙酮和异丙胺的转氨酶活性变化
具体反应值如下（反应时间均为24h）：
水单相：苯乙酮50g/L，转化率80%，ee值99%
双相：苯乙酮400g/L，转化率5%，产品浓度20g/L
纯底物（含有PLP和湿细胞的2%水溶液）：产品浓度100g/L。 进一步采用连续反应器，每24小时时空收率可达168g/L。
参考专利：；
1.5 溶剂体系的选择
对于不同的反应，选择溶剂体系时考虑的因素也不同。 溶剂体系种类繁多，选择合适的溶剂体系是很困难的。 在这篇综述中，几位作者提供了研发团队和工业生产的流程图，这对于溶剂体系的选择非常有帮助（原图3&4）。
图3&4确定哪种溶剂体系适合生物催化反应的流程图
（图中蓝色框是可以通过查阅文献解决的问题，橙色框内的问题需要实验验证）
2、非常规溶剂的选择
通过流程图确定溶剂体系后，需要进一步选择反应所用的溶剂。 选择溶剂时，需要考虑多种因素，本综述主要分为两类——对反应的影响/对环境的影响。
2.1 常见非水溶剂及其应用
除了最常用的有机溶剂外，文献中还提到了其他几种溶剂。
离子液体（ionic，IL）和低共熔试剂（deep，DES）是最常见的有机溶剂替代品。 前者是阴离子和阳离子松散结合形成的液体，而后者则具有卤化物盐和氢键供体。 作品。 两者均不挥发且不易燃，因此安全且易于后续处理。 然而，ILs的生产过程比较繁琐。 相反，用可再生能源合成DES的能力已成为一种更有利的替代方案。
超临界流体（SCF）是一种新型溶剂，是在特定压力和温度下介于液态和气态之间的气体。 它们的溶解度可以通过改变反应温度和压力来改变。 最常见的例子就是超临界CO2，它含量丰富且不易燃，具有很多优点，但也需要特殊的压力设备，因此无法在普通实验室中使用。
下表（原表4）列出了上述溶剂的应用体系（颜色越深，溶剂应用的相关文献越多）、溶解度影响因素及实例。
表4 文献中几种溶剂生物催化的相关应用案例、一般特点及常见例子
*DMSO：二甲亚砜； CPME：环戊基甲基醚； MBTE：甲基叔丁基醚
*[BMim]：1-丁基-3-甲基咪唑； [Bpy]：N-丁基吡啶； ChCl：氯化胆碱； [EACl]：乙基氯化铵
2.2 溶剂对反应的影响
当谈到溶剂对反应的影响时，最需要考虑的因素有两个：对酶性质（稳定性、活性和选择性）和溶解度的影响。 在双相系统中，它还可以扩展到溶剂中化合物的作用。 分配系数。
从整体流程来看，还应该考虑下游处理流程（DSP）的难度。 根据以上因素和回顾，可以整理出适合不同溶剂体系的溶剂类型。
溶剂
系统
要求
选择溶剂特性
共溶剂
1、与水混溶；
2. 可提高底物在水中的溶解度；
3、对酶性质影响小；
4、简化后续废水处理；
1、低LogP*或极性溶剂，如小分子醇（如乙醇、异丙醇）等；
2.DMSO满足上述条件但分离困难，DSP困难。
双极性
系统
1、具有两相，要求化合物在两相中合理分布，以增加负载能力；
2.不影响反应（如溶剂抑制酶或影响稳定性等）。
1、适中的分配系数**（太高可能会损坏酶）；
2.溶剂和溶质的LogP值相似；
3.不影响酶对底物的亲和力。
火星
1、增加基板承载能力；
2.不影响反应（如溶剂抑制酶，或影响稳定性等）。
1、非极性溶剂；
2、避免破坏水化膜，影响酶活性； 提高底物溶解度。
*LogP表示物质在正辛醇（油）和水中的分配系数比的对数值，反映物质在油相和水相中的分布情况。 该值越大，该物质的亲脂性越高，水溶性越差。
**影响分配系数的因素：logP、受氢/供氢能力、极化率、溶剂体积比、溶解度参数等。
2.3 溶剂对环境的影响
关于溶剂对环境的影响，最常见的误解是水容易获得且无毒，使其成为“绿色溶剂”，而有机溶剂一般对环境不友好且不可持续。 但实际上，由于化合物的溶解度较差，单水相体系往往需要使用大量的水，相应地产生污染废水，并且需要大量的萃取试剂来萃取产物； 而大多数有机溶剂，虽然确实容易增加环境负担，但也有一些对环境影响较小的试剂，例如一些由可再生资源并以环保方式生产的试剂（例如低共熔溶剂），并且可以被重用。
同时，DSP处理的难易程度并不完全与它对环境的有益程度有关。 DSP处理的影响因素包括溶剂粘度、挥发性、稳定性、共沸物的形成等，而是否环保则取决于溶剂挥发性、稳定性、闪点、爆炸性、毒性等。
因此，我们需要做的不是盲目否定非水溶剂，而是在选择溶剂之前合理评估其对环境的影响。 Prat团队等研究机构总结了许多常用溶剂的特点，从安全、健康和环境方面将其分为三类：“推荐使用”、“有问题”和“危险”。 下表（原表 5）中提供了一些示例。
表5 生物催化溶剂的具体实例及其安全等级
*：二氢葡萄糖苷； p-：对伞花烃；：柠檬烯
3、酶稳定性问题的解决方案
有机溶剂对酶的稳定性有或多或少的影响。 审查中包括以下主要解决方案：
这篇综述还列出了酶在不同状态下的优势和挑战，具体如下表（原表3）。
表3 不同状态下酶的优势与挑战
以及在不同反应体系中的应用
4. 前景
本文作者认为，我们不能总是坚持在生物催化反应中使用水单相体系。 随着各种化合物需求的增加，非水溶剂的应用是不可避免的。
当然，有机溶剂还存在许多问题和挑战亟待解决。 例如，目前很难预测某种溶剂对于某种反应的适用性，但作者认为在不久的将来应该有更多的模拟工具来帮助选择最合适的溶剂。 对于有机溶剂的合成工艺，可以从原料（可再生资源）和合成方法（生物合成、发酵等）两个方面入手。
在本文的最后，作者鼓励生物催化领域的研究团队尝试不同的溶剂系统和非常规介质。 这是扩大和推广这些溶剂在工业领域应用的最佳途径。 同时，随着有机溶剂应用的扩大，酶与化学催化反应相结合的级联反应也将具有重要的潜力。