【视频大赛优秀作品】镍亲和层析介质的再生

作者︱王超、王雷

︱Bio-第三届生物实验短视频大赛

镍亲和色谱介质的再生

第三届影像大赛优秀奖

镍介质（Ni-NTA 树脂）是蛋白质纯化实验中亲和层析常用的材料。它可以与带有 (His)6 标签的蛋白质结合以提取蛋白质。然后用咪唑溶液竞争性洗脱蛋白质以供使用。随后进行纯化。介质（Beads）中残留的脂质、去污剂和疏水性相互作用蛋白可以通过梯度乙醇去除；培养基上残留的变性蛋白沉淀可用盐酸胍去除，EDTA螯合结合法可去除培养基。卸下并重新安装其上的镍，以增加介质的结合能力。经过多次实验后，培养基中残留蛋白质和镍的损失会导致培养基的蛋白质结合能力和特异性逐渐下降。此时镍介质的再生是一种方便快捷的提高键合效率的方法。通过镍亲和介质的再生实验，可以显着提高旧介质结合目标蛋白的能力。

1、实验材料及试剂仪器

1. 样本信息

较旧的镍亲和层析介质结合能力降低

2. 试剂及耗材

（以再生50mL镍培养基为例）

1.纯水1L

2. 1-2个洁净重力柱

3. 6 M 盐酸胍 200 mL

4. 25%/50%/75%(v/v) 乙醇各 50 mL

5. 0.1 M 硫酸镍 200 mL

6. 0.1 M EDTA pH 6.0 200 mL

7. 保存液（20%乙醇PBS溶液）100 mL

所有溶液均应使用 0.45 μm PVDF 膜过滤

3、仪器及软件

清洁空重力柱和柱架

旋转混合机

2. 实验操作

1.将2CV纯水过柱

2. 1CV 25%乙醇—1CV 50%乙醇—2CV 75%乙醇—1CV 50%乙醇—1CV 25%乙醇

3. 梯度乙醇去除残留脂质、去污剂和疏水相互作用蛋白

4. 2CV纯水

5. 5CV 0.1M EDTA

6. 将镍螯合在介质颗粒上以去除金属结合的杂质

7. 2CV纯水

8. 2CV 6M 盐酸胍

9. 盐酸胍去除变性和沉淀的蛋白质

10. 5CV纯水

11. 2CV 0.1 M 硫酸镍，孵育 10 分钟

12.镍与介质重新结合

13. 2CV存储方案

注：CV代表柱体积

3、注意事项

1、镍亲和介质的储存环境温度建议为4度，不能在零度以下的环境中冷冻。需要始终处于液体环境，不能风干。

2. 重组目的蛋白的产量和纯度取决于蛋白的构象、溶解度和表达水平。如果培养基结合异常，则应优化并进行小规模制备，以估计表达和溶解度水平并排除蛋白质本身的干扰。

3、亲和实验中应避免使用含有EDTA的蛋白酶抑制剂，因为EDTA会不可逆地影响介质的结合能力。

四、单位简介

省部共建作物逆境适应与改良国家重点实验室（英文名称：State Key of Crop and（以下简称实验室））前身为河南省植物生理生化重点实验室大学（1991）。经历了河南省植物逆境生物学。重点实验室（2005年）、植物逆境生物学教育部重点实验室（2005年）、河南省作物逆境生物学协同创新中心（2012年）、国家“作物逆境生物学学科创新引进基地”（2016年）等发展阶段，经过近30年的创新发展，省部共建国家重点实验室于2019年11月5日获科技部批准建设。

实验室面向国家现代农业可持续发展的战略需求和植物科学发展的国际前沿，聚焦生物学和农业领域的重大科学问题，结合黄淮海地区特点，聚焦逆境农业生产实践重大创新基础和应用基础。研究，以提高小麦、玉米、大豆、油菜等重要作物的抗逆性、品质和产量为目标，建立和开发先进技术平台支撑系统，开展作物抗逆分子机制研究和作物分子遗传改良，为国家和地区粮食安全、生态安全以及水土资源有效利用提供重要支撑（更多实验室信息请登录实验室网站）。