华理许建和等获NADH再生强于葡萄糖脱氢酶的异丙醇脱氢酶突变体

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氧化还原酶是一类重要的生物催化剂，用于合成各种手性分子，其辅因子通常是不稳定且昂贵的NAD(H)/NADP(H)。辅因子再生策略是解决生物催化中辅因子不稳定和/或昂贵问题的常用手段。异丙醇脱氢酶（IPADH）具有再生NAD(H)/NADP(H)的潜力，但异丙醇脱氢酶热稳定性差以及专门使用NAD(H)作为辅因子阻碍了其在辅因子再生中的应用。近日，华东理工大学徐建和团队通过半理性设计获得了两种异丙醇脱氢酶突变体：40℃半衰期提高了433倍，活性提高了3.3倍；：它可以专门使用NADP(H)作为辅因子。文章发表于，标题为：for of。

研究人员通过底物筛选异丙醇脱氢酶，筛选出对异丙醇具有氧化活性、对丙酮具有还原活性的猪布鲁氏菌异丙醇脱氢酶，其以NAD(H)为辅因子，在40℃下半衰期为19分钟，不能满足实际应用的需要。

为了提高其热稳定性，研究人员与同源的耐热酶进行了多序列比对，推测比对结果显示的9个保守氨基酸与热稳定性有关，并对这些位点进行定点饱和诱变，发现R48L突变体可使温度半衰期提高6.9℃。

为了进一步提高其热稳定性，研究人员对已解析的脱辅基异丙醇脱氢酶的温度因素进行了分析，发现了两个可能与温度稳定性有关的柔性片段。通过局部序列比对，他们找出了各种温度稳定性好的酶的相关柔性片段，并将这些片段“替换”到相应的位置。结果显示，用链霉菌产色羰基还原酶的柔性片段替换193-200位氨基酸残基的突变体，酶活提高了1.5倍，半衰期温度为10.4℃。

为了进一步探究“替换”位置上各氨基酸残基的作用，研究人员对替换的氨基酸残基进行了回复突变。结果发现，193和199位回复突变后活性和热稳定性均大幅降低。因此，193和199位的“替换”被保留。基于以上结果，研究人员构建了R48L、N193T、K199Y突变体，在40℃下半衰期增加了433倍。

为了将IPADH辅因子拓展为NADP(H)，研究人员对严格依赖NADP(H)辅因子的脱氢酶进行了多序列比对，结果显示36、37、38位氨基酸残基相对保守，推测与辅因子选择有关。通过对这三个氨基酸进行定点诱变并构建文库，筛选出D36G、F37R、S38G突变体，它们可以利用NADP(H)作为辅因子，特异性是NAD(H)的1倍，但半衰期温度降低至34.6℃。

进一步检测了亮氨酸脱氢酶和类固醇脱氢酶的NAD(H)再生能力，发现亮氨酸脱氢酶的再生能力强于葡萄糖脱氢酶和乳酸脱氢酶； -检测了单加氧酶的NADP(H)再生能力，发现单加氧酶的再生能力强于甲酸脱氢酶。

综上所述，研究人员通过同源序列比对，确定关键氨基酸残基，柔性片段置换等方法，对猪布鲁氏菌异丙醇脱氢酶进行半理性改造，获得了突变株，其40℃半衰期提高了433倍，活性提高了3.3倍，并且该突变株可以特异性地利用NADP(H)作为辅因子，扩大了NAD(H)/NADP(H)再生工具酶的选择范围。

（史国龙译）