2014, 48(10): 11~13/薛庆红, 等.中国兽医杂志 犬细小病毒特异性抗血清的制备及应用 薛庆红1号，李润2号，殷春生1号，支海兵1号，夏业才1号，李宁1号（1.中国兽药监督管理局，北京；2.北京中海生物技术有限公司，北京）【收文日期】2014-06-12【文献标识码】A【货号】1002-1280（2014）10-0011-03【中法文号】S852。 655 [摘要] 为了制备犬细小病毒特异性抗血清，用犬细小病毒DD株免疫健康易感犬，无菌采血后分离血清，制备犬抗CPV -2血清。制备的血清经SN、ELISA、IFA、HI等方法检测，均未检出犬5种常见病毒抗体，表明该血清具有良好的特异性。经测定，血清中和抗体效价为1：512； HI效价为1:1280。应用结果表明，该血清对不同犬细小病毒毒株具有同等的中和能力，对CPV-2感染犬具有良好的治疗效果。 [关键词] 犬细小病毒；抗血清；筹备基金项目：科技部基础科技工作项目（） 作者简介：薛庆红，副研究员，从事兽用疫苗检验检测方法研究。电子邮件：@ivdc。政府。 TI - Y -HONG1, , ｚHihai -Bi NG1, XIAYE -CAI1, (, 北京 1081, 中国) 摘要: mmu 英迪-CPV -2 。通过 SN、ELISA、IFA 或 HI 检测 eeeee血清效价SN为1∶512，HI为1∶1280。 ，也可用于治疗CPV-2犬。关键词： 犬细小病毒；花粉抗体；准备工作 犬小病毒（CPV）可引起幼犬并引起急性传染病。其特点是危害养犬业的严重传染病 1.表现为剧烈呕吐、出血性肠炎、明显白细胞减少或心肌炎；主要影响12周龄以下的断奶幼犬，其中2～4月龄的幼犬最为易感，发病率高达90%[1]。
犬细小病毒Ⅱ型（ type 2，CPV2）是一种新病毒，起源于20世纪70年代末。它与食肉动物细小病毒关系极为密切，与猫泛白细胞减少症病毒关系密切。水貂细小病毒（FPLV）、水貂肠炎细小病毒（MEV）、蓝狐细小病毒（BFPV）和浣熊细小病毒（RPV）同属细小病毒科、细小病毒亚科。 ridae）自主复制细小病毒[2]。作为细小病毒中变异性最强的病毒，随着新突变株(CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c)的出现，CPV-2感染的宿主范围不断扩大[1]。目前，预防犬细小病毒病的主要方法是接种疫苗。病犬的治疗方法是给早期犬注射抗CPV血清或抗CPV单克隆抗体，同时辅助输液、输血、静脉注射犬免疫球蛋白或血白蛋白等。从出血性肠炎犬粪便中分离得到犬细小病毒株，并在此基础上制备了CPV-2·11·中国兽医杂志2014，48(10)：11-13/薛庆红，等。特异性抗血清，并对血清进行了系统研究。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病毒 CPV-2、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型、狂犬病病毒均由本实验室保存。 1.1.2 实验动物2～3月龄健康、易感犬购自北京马斯生物技术有限公司。
1.1.3 细胞和培养基猫肾细胞（CRFK）和犬肾细胞（MDCK）由中国兽药监督研究院提供，MEM培养基和胎牛血清购自赫克伦生化（北京）有限公司1.1.4 主要试剂犬腺病毒Ⅰ型、犬腺病毒Ⅱ型ELISA试剂盒购自IDEXX公司； CPV-2、CDV、CPIV、CAV Ⅰ型抗原、FIT C标记抗狂犬病单克隆抗体、BVDV阳性 血清由本实验室提供； FITC 标记的羊抗牛 IgG 购自 Sigma。 1.2 方法 1.2.1 实验动物的筛选。通过心脏采集犬血清，筛选CPV-2病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒II型、狂犬病病毒抗体。使用全部呈阴性的两个月大的比格犬进行血清制备。 1.2.2 CPV-2DD毒株的繁殖和纯化。将CPV-2DD菌株以3%浓度同步接种至CRFK细胞悬液中，分装于细胞瓶中，37℃培养。当细胞病变达到70%以上时，收获病毒液并传代。 2至3代后，收获细胞培养物。培养物反复冻融3次后，/min离心10min，上清液-20℃保存备用。 1.2.3免疫与采血：首次免疫采用犬细小病毒灭活疫苗。 21天后口服2mL CPV-2DD株病毒液加强免疫。第三次免疫在第二次免疫后21天进行，每只犬进行肌内注射。 CPV-2DD株病毒液2mL。
免疫后14天从心脏采血，分离血清，-20℃保存备用。 1.2.4 血清检验 1.2.4.1 无菌检验按参考文献[3]进行。 1.2.4.2特异性试验：采用SN法检测CPIV抗体和CDV抗体；采用HI和ELISA方法检测CAV I型抗体；采用ELISA法检测CAV II型抗体； F 采用AVN法检测RV抗体；采用IFA法检测BVDV。抗体[4]。 1.2.4.3效价测定按照参考文献[5]进行HI效价测定；血清中和抗体效价测定参照文献[6]进行。 1.2.5 为测试不同毒株的中和能力，选取本实验室保存的3株犬细小病毒疫苗，分为2组，进行10倍系列稀释。一组用犬细小病毒抗犬血清中和，另一组加入等体积的生理盐水作为对照。根据细胞病变孔数，按照Reed-法计算，比较犬细小病毒抗血清对不同毒株的中和能力。 1.2.6 病犬治疗试验。测试幼犬被分为2组，每组2只狗。所有犬均肌肉注射2 mL CPV DD F2代细胞培养物；隔离2天后，第1组每天早、下午肌注犬细小病毒特异性抗血清2mL，连续5天。另一组每天早、下午肌注生理盐水2mL，连续5天。每天测量和观察他们的体温。临床症状。
2 结果 2.1 免疫方案的探索及抗血清的制备。通过离心去除CPV-2DD株病毒液中的细胞碎片，以减少原始细胞培养物中的非特异性成分对免疫动物的刺激。将离心后的CPV-2 DD株灭活，制备成犬细小病毒灭活疫苗，用于动物首次免疫。经过两次口服和肌内注射加强免疫后，犬细小病毒抗血清滴度达到预期水平，并从血液中采集1000 mL抗血清。 2.2 血清特异性测试采用SN、ELISA、HI、FAVN、IFA方法测试制备的血清的特异性。未检出犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒II型。和狂犬病病毒抗体，说明该血清具有良好的特异性。检测结果见表1。 表1 血清特异性检测结果 抗体检测方法 检测结果 犬瘟热病毒抗体 SN 阴性 犬副流感病毒抗体 SN 阴性 犬腺病毒I型抗体 HI/EILSA 阴性 犬腺病毒II型抗体 ELISA 阴性 狂犬病病毒抗体 FAVN 阴性牛腹泻病毒抗体 IFA 阴性 SN 表示血清中和试验； HI表示血凝抑制试验； ELISA是指酶联免疫吸附测定法； FAVN表示荧光抗体中和试验； IFA即间接免疫荧光试验。 2.3血清抗体滴度 测得HI滴度为1:1280；血清中和抗体滴度为1:512。
· 2 1 · 2014, 48(10): 11～13/ 薛庆红, 等.中国兽药杂志 2.4 不同犬细小病毒毒株中和指数实验结果见表2。 表2 CPV -2 骨毒株病毒含量测定结果及毒毒株命名病毒含量中和指数计算（/0.1） mL) 中和组对照组 CPV -2 A1 101.7106.8105.1 CPV -2 A2 A2 101.5106.5105.0CPV-2 A3 101.1106.2105.12.5 病犬治疗结果。试验犬中毒后出现体温连续升高、呕吐、便血等临床症状。对照组暴露于毒物。治疗组犬在中毒后第7天和第8天死亡；连续注射抗血清5天后，治疗组犬全部存活，状态良好。收集死狗的粪便和内脏，无菌研磨并离心。上清液接种CRFK细胞。可以看到细胞变圆和脱离等CPE。本实验室制备的抗血清可以特异性抑制这种CPE。 3 讨论与总结特异性抗血清是菌株和活疫苗检测中常用的标准物质。涉及的检测项目包括外源病毒检测、特异性检测、鉴定检测、功效检测等。基于上述检测用途，特异性是抗血清的首要要求。本试验制备的犬细小病毒抗血清未检出犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒I型、犬腺病毒II型、狂犬病病毒抗体，表明血清特异性良好。
由于犬细小病毒疫苗毒株不同，为了客观评价疫苗的质量，要求抗血清对不同毒株的CPV-2具有相当的中和能力。本研究利用该抗血清对实验室保存的3种犬细小病毒疫苗株进行实验。测定中和指数，发现CPV-2 DD株制备的犬细小病毒抗血清对不同疫苗株具有相当的中和能力。肖飞等[7]于2010年制备了抗犬瘟热和犬细小病毒双卵黄抗体，并通过实验证明了特异性抗体对犬细小病毒的治疗作用。与本研究制备的抗体相比，蛋黄抗体具有更高的抗原结合效率，更适合诊断。但其制备方法较为复杂，不适合初级生产使用。犬细小病毒抗血清在实践中也常用于治疗患有犬细小病毒的狗。感染CPV的犬起病急、死亡率高，且常呈暴发性流行；临床上主要采用对症治疗结合高免血清和单克隆抗体治疗。本次试验结果表明，本研究制备的犬细小病毒抗血清对病犬具有良好的治疗效果。王同光等.等[8]采用犬细小病毒单克隆抗体联合犬免疫球蛋白治疗279例犬细小病毒感染犬，治愈率为81.34%，为CPV感染犬的治疗提供了新思路，但单克隆抗体的制备受成本、工艺等诸多因素限制，性价比较低；与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有优异的靶向特性，但在与病毒结合方面不具备优势。这也是单克隆抗体在临床应用中治疗效果不理想的原因。原因。
研究表明[9]，犬细小病毒超免血清在临床治疗中的治愈率可达94.4%，展示了犬细小病毒抗血清在实际应用中的潜在价值。参考文献： [1] K, C R. 碳孔动物细小病毒的出现[J] 兽医研究, 2010, 41(6): 39-51. [2] 卡迈克尔·LE。犬细小病毒的历史解释[J]兽药学报(B辑),2005,52(7-8):303-303-311。 [3]中国兽药典委员会。中华人民共和国兽药典2010年版第3版