默克公司JACS：光促镍催化水相硫-芳基抗体偶联及ADC应用

默克公司JACS：光促镍催化水相硫-芳基抗体偶联及ADC应用

介绍

近日，默克公司Simon B. Lang研究团队报道了一种新型光促进镍催化水性硫芳基抗体生物缀合技术，该技术可以将肽和蛋白质与半胱氨酸残基进行化学选择性芳基化并成功用于抗体药物偶联物ADC的制备。 通过该技术，众多芳香烃连接体可以与小分子化合物、探针和细胞毒性有效负载有效结合。 此外，通过在体外构建多种具有靶向介导的细胞毒活性的新型ADC，进一步证明了这种新型生物共轭平台在药物开发领域的前景。 相关研究成果近期发表在美国化学会杂志（J. Am. Chem. Soc. DOI: 10.1021/jacs.）上。

背景介绍（一）：

生物制剂药物可以以小分子药物无法实现的方式调节疾病领域的靶标，从而改变临床格局。 下一代疗法的发现和优化依赖于选择性蛋白质相容合成技术的发展。 抗体药物偶联物 (ADC) 可以通过合成接头将小分子有效负载连接到抗体以进行靶向递送 (1)。 目前全球共有12种ADC作为药物使用，超过140种ADC正在进行临床试验。

现代报道的 ADC 设计通常利用抗体上的半胱氨酸残基（S 末端）和连接器有效负载上的马来酰亚胺（C 末端）的特异性偶联（1，顶部）。 所得 ADC 是琥珀酰亚胺非对映异构体的异质混合物，容易通过逆迈克尔反应或其他机制在体内过早释放有效负载。 用非手性芳基亲电子试剂取代马来酰亚胺虽然非常理想，但目前仅限于反应性芳烃支架，并导致硫醚易于生物活化/亲核取代途径。

（1，来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了解决这些缺点，美国默克公司的Simon B. Lang研究团队计划开发一种金属介导的水性SC(sp2)交叉偶联反应，以方便地偶联含有芳基连接体的小分子有效负载。 针对抗体半胱氨酸残基。 然而，已报道的生物相容性半胱氨酸残基-芳基偶联技术，包括利用嘧啶砜、邻硝基芳基硼酸和预制钯配合物的方法，都存在一定的缺点（1，上图）。 可见光催化可以刺激和维持镍催化循环，并且与生物分子（肽、蛋白质和DNA）具有广泛的相容性。 基于此，团队成功开发了一种水相容的镍/光氧化还原介导平台，能够实现抗体半胱氨酸残基与溴化芳香烃的直接偶联（1，下）。 反应设计的关键是找到一种自牺牲电子给体，有利于光催化下同时生成低价镍和芳基卤化物氧化加成配合物，同时避免高反应性氨基酸残基的氧化。

耦合技术发展和基板扩展（表1）：

作者选择谷胱甘肽（GSH）和溴化芳烃作为底物，Ru(bpy)3(PF6)2(1)作为光催化剂，450 nm LED作为光源，体积比为4:1的H2O/DMSO作为溶剂。 ，进行反应可行性研究。 通过优化配体和碱（SI中的1-3），得到最佳反应条件如表1所示，其中水溶性配体dabpy与溴化镍反应生成稳定的催化剂Ni(dabpy)空气和水。 )Br2 (2), DIPEA 在反应中充当碱和电子供体。 该反应在存在多种易发生络合或氧化的氨基酸添加剂的情况下运行良好（SI 中的表 4），使得该反应对肽和蛋白质具有耐受性。 对照实验表明，光催化剂1、镍催化剂2和光对反应至关重要，缺一不可（SI表5）。

基于优化的反应条件，作者随后对溴代芳香烃和肽进行了底物扩展研究（表1）。 缺电子/中性/富电子的溴代芳香族化合物(3-5)、吡啶(6, 7)、嘧啶(8, 9)和尿苷(10)都与该反应相容，并且该反应与芳香族化合物相容烃底物有胺、酰胺、醇、酸、核苷、磺酰胺、氰基等基团。 此外，多种含半胱氨酸的肽也适合该反应，并且可以选择性地在S位上偶联，以可观的产率产生相应的偶联产物11-15。 该反应耐受所有天然氨基酸基团，包括可氧化基团Tyr、Trp、Met，碱性基团Lys、Arg、His，醇类Ser和Thr，羧酸Glu和Asp等。

（表 1，来源：J. Am. Chem. Soc.）

ADC应用（2-4）：

作者首先选择基因工程抗体进行偶联尝试，研究该反应在ADC中的应用。 抗Trop-2抗体变体在重链（HC）中含有两个基因工程半胱氨酸残基，因此被选为缀合测试抗体。 如图2所示，该抗体可以与负载吡哆醇的接头负载Br-Py-PEG4-(16)偶联，得到DAR（drug-to-ratio，药物抗体比），产率80%。 ADC 为 1.5。 偶联反应选择性地发生在含有半胱氨酸残基的重链上，而不含半胱氨酸残基的轻链（LC）则不偶联（经质谱证实）。 尺寸排阻层析（SEC）分析、毛细管电泳（CE-SDS）纯度分析和细胞结合检测（cell-）均证实抗体在反应前后均能保持其完整性。 此外，利用这种光/镍催化的偶联反应，该抗体还可以与负载长春花碱的接头负载 Br-Py-AA-PABQ-(17) 偶联，得到的 DAR 为 1.2，产率为 86 %。 ADC。 该反应还具有优异的化学选择性和稳定性。

（2，来源：J. Am. Chem. Soc.）

为了进一步证实该偶联反应在ADC中的应用前景，作者尝试对天然单克隆抗体的链间二硫键进行偶联，以获得高DAR值的ADC。 天然单克隆抗体有4个链间二硫键：2个重链-重链间二硫键和2个重链-轻链间二硫键，因此理论上可以偶联8个有效负载。 流程操作范式如图3所示：先用TCEP（三（2-羧乙基）膦盐酸盐）还原单克隆抗体的四个二硫键，然后在同一瓶中进行偶联反应。 获取相应的ADC。 基于此操作，作者成功验证了4种mAb：抗Trop-2 mAb、抗ROR1 mAb、抗Her2 mAb、mAb变体，4种连接子负载：16、18-20和10溴化碳氢化合物：21-30 。 实验都可以得到相应的ADC具有较高的DAR值（4.3-8.0）。

（3，来源：J. Am. Chem. Soc.）

最后，作者使用这种抗体偶联方法合成了五种细胞毒性 ADC 并测试了它们的有效生物活性。 如图4所示，作者将经典的E、DM1、DXd细胞毒素与可裂解接头或不可裂解接头组合，形成接头负载，然后通过2或3中描述的方法将其偶联到单克隆抗体上，得到5个细胞毒性 ADC。 细胞杀伤测试表明，五种 ADC 对高 Trop-2 表达的癌细胞系（JIMT-1、HCC78、BxPC-3、MDA-MB-468）表现出与 DAR 值成正比的有效细胞毒性 (IC50)。 = 0.03-0.9 nM）。 相比之下，五种 ADC 对 Trop-2 阴性癌细胞系 (SW620) 表现出更差的毒性（>300 倍），证明了细胞毒性的靶向性质，并且与生物缀合中产生的效果一致。 半胱氨酸-芳基键的高背景稳定性。

（4，来源：J. Am. Chem. Soc.）

总结

总之，美国默克公司Simon B. Lang研究团队开发出光促进镍催化抗体生物缀合技术，为新型高效ADCs药物的制备提供了新策略。 作者希望这种蛋白质修饰方法能够在学术界和工业界得到广泛应用。