尿素的检测方法
背景和概述[1][2]
尿素也称为尿素或碳酰胺。 无色晶体。 熔点132.7℃。 比重1.335(20/4°)。 溶于水和乙醇。 它是人类和哺乳动物蛋白质代谢的终产物，也是动物排泄的主要有机氮化合物。 在海洋环境中普遍存在，主要来自海洋动物的排泄物以及异养微生物对蛋白质和氢的分解； 人类活动也对沿海水域有一定的投入。 尿素是浮游植物可利用的氮源； 在化学上它可以参与多官能缩聚物的形成。 海水中的浓度随着浮游植物的增减而波动，但代表性浓度值为5微克碳/升。 尿素是氨基酸代谢的最终产物。 它在肝脏中合成，可以从肾小球自由过滤。 40%-50%在肾小球髓质部分被动重吸收。 据相关文献报道：当人体尿素含量超过自身吸收能力时，会对人体的肝脏、肾脏、肺泡等造成危害。
应用[2]
尿素是一种优质、高效、重要的氮肥，适用于多种作物。 也可作为反刍动物的补充饲料。 工业上，尿素是合成脲醛、三聚氰胺甲醛树脂等的原料，医药上用于制造四环素、苯巴比妥、咖啡因等药物。 染料工业用于生产还原棕BR、酞菁蓝B等。
尿素在土壤中的行为[3]
尿素施入土壤后，在脲酶的作用下水解成NH+4和NH3。 NH3在钙质土壤旱田或pH值较高的水田中易造成NH3挥发损失； 在NH+4存在的情况下，土壤硝化细菌繁殖并将NH+4转化为NO-3。 虽然NH+4和NO-3都是作物所需的氮源，但NH+4很容易被土壤颗粒吸附，而NO-3则随着雨水或不当灌溉水而流失。 此外，土壤中的反硝化细菌还可将NO-3还原为NO-2，并进一步转化为NO、NO2、N2，造成氮素损失。 过量施用氮肥都会加剧这些过程。 因此，选择合适的脲酶抑制剂和硝化抑制剂来抑制脲酶和硝化细菌等微生物菌群的活性，选择合适的限制溶解的物质，或者在尿素颗粒表面包覆一层薄膜来限制尿素的溶解，都可以减缓尿素的溶解。提高尿素溶解分解速度，延长尿素有效期，减少损失，提高尿素利用率。
检测方法[4]
目前，国内外测定尿素的方法有很多种，概括起来有：直接比色法、间接比色法、色谱法、中红外光谱法等。
1. 直接比色法
直接比色法是利用特殊试剂直接与尿素反应产生显色反应，然后用分光光度计测量特定波长下的吸光度，进而换算成尿素含量。 常用的直接比色法有三种：二乙酰肟法、邻苯二甲醛法、对二甲氨基苯甲醛法。 但现阶段亚硝酸盐-格赖斯试剂法只能定性，不能定量。
1) 二乙酰肟比色法
二乙酰肟显色法又称二乙酰肟法。 该方法的原理是：在强酸加热条件下，尿素与丁二酮反应生成红色原二嗪（），颜色深浅与尿素含量成正比。 成比例的。 由于二乙酰不稳定，常用二乙酰肟代替。 当暴露于酸时，二乙酰肟水解成二乙酰。 该方法显色反应中产生的络合物对光不稳定。 研究证实，在试剂中添加一定浓度的安替比林、硫脲、金属离子等，可以提高尿素与丁二酮反应的灵敏度，还可以增加其显色的稳定性。 该方法所用试剂易得、成本低廉，但操作时需要加热煮沸，且线性范围较窄。 使用的试剂有毒、有腐蚀性，极易污染环境。 因此，该方法仅适用于实验室标准操作，一般不适用于现场快速检测。
2) 邻苯二醛法
邻苯二甲醛比色法，该方法的原理是：在酸性环境下，尿素与邻苯二甲醛作用于安替比林，生成黄色化合物，与偏钒酸根结合后变成深蓝色。 深度与尿素含量成正比。 据研究，邻苯二甲醛是显色剂，4-氨基安替比林是促进剂，偏钒酸铵是转色剂。 其中4-氨基安替比林和偏钒酸铵的用量对反应速率和显色程度起着关键作用。 该方法不需要煮沸，线性可达/L，精密度、准确度和相关性都很好，而且不需要特殊仪器和特殊试剂。 成本低廉，可实现自动化分析，试剂稳定，可常温保存，变异系数小，干扰因素少。 实践证明，该方法是一种经济、实用、值得推广的尿素测定技术。 但该方法灵敏度较低，不易检测出溶液中的微量尿素。 但该方法在检测尿素含量小于3.0mg/L时灵敏度不够，因此该方法在检测低尿素浓度样品时存在一定的局限性。
3) 对二甲氨基苯甲醛法
对二甲氨基苯甲醛（PDAB）比色法。 该方法的原理是：在酸性溶液中，尿素与p-PDAB反应生成对二氨基苯甲醛尿素。 该物质呈柠檬黄色，颜色深浅与尿素含量成正比。 成比例的。 该方法显色温度为25-30℃，显色时间为5分钟。 据文献报道，该方法中控制PDAB的用量很重要。 该方法在尿素浓度4～60mg/L范围内线性良好，稳定性好，干扰少，操作简单。 这是测定尿素常数的好方法。 由于该方法灵敏度不高，一般用于乳制品、饲料等食品中尿素的检测。 该方法也用于测量废水中的尿素。
4) 亚硝酸盐-格赖斯试剂法
尿素在酸性溶液中与亚硝酸盐反应生成氮气，而格里斯试剂可与亚硝酸盐偶氮基反应生成紫红色染料。 因此，待测样品溶液在酸性条件下与一定量的亚硝酸盐反应一段时间后，加入格里斯试剂，通过溶液颜色与标准品颜色的比较来判断尿素的存在解决方案。 该方法主要用于乳制品中尿素的检测以及尿素的定性测定。 在朱秀高等人的研究下[15]，对试剂进行了改进，不再需要强酸，并且可以在室温下反应，反应时间短。 也缩短至10分钟，减少了假阴性结果的发生，反应灵敏度为0.2%。 但目前尚未见利用该方法定量检测尿素的报道。
2. 间接比色法
间接比色法是检测尿素酶解后的产物，然后换算成尿素含量。 已知尿素在脲酶存在下会发生以下反应：
在一定条件下，NH+4和CO2的生成量与尿素浓度成正比。 一般情况下，尿素含量是通过分光光度法检测氨含量来间接检测的。 脲酶的本质是蛋白质，在37℃时有活性。 随着温度、水分等的变化，脲酶的活性也会发生明显的变化，因此该方法有一定的局限性。 例如，游泳水中经常添加藻类抑制剂硫酸铜。 铜离子会引起脲酶失活，严重干扰测量。 实验证明，在样品中添加二乙基二硫代氨基甲酸钠-氯仿可以去除铜离子，避免铜离子的产生。 离子干扰。 同时，另一项实验发现游泳池水中的余氯会影响脲酶活性并干扰测量，目前尚未开发出合适的掩蔽方法。 此类研究也在逐年增多。 目前常用的间接比色法有脲酶-博世比色法、酶偶联法、甲酚红法、酶电极法等。
1) 酶偶联法
脲酶分解尿素产生的氨在谷氨酸脱氢酶（GLDH）的催化下，在T-乙酰丙酸和还原型辅酶I（NADH）存在下生成谷氨酸。 同时，NADH被氧化成氧化辅酶I（NAD）。 NADH在波长340nm处有吸收峰，其吸光度下降速率与待测样品中尿素含量成正比。 该方法的优点是特异性高、快速、结果准确、精密。 它是目前测定尿素的首选化学方法。 2011年颁布的中华人民共和国卫生行业标准中血清尿素测定的参考方法也采用谷氨酸偶联法。 但该方法所用试剂价格昂贵，且溶解后极不稳定。 大多数都需要紫外分光光度计，这是不合适的。 用于手动和紧急分析。
2) 脲酶-博世比色法
脲酶水解尿素产生NH+4和CO2。 在碱性条件下，亚硝基铁氰化钠催化NH+4与苯酚、次氯酸盐反应生成蓝色化合物。 该方法目前应用领域非常广泛，包括临床医学、环境等领域。 李建元[20]指出，与以往使用的二乙酰单肟法相比，该方法能有效缩短反应时间，灵敏度高、线性好、精密度好，且不需要避光。 其精密度和准确度满足国家标准测量游泳池水中尿素的要求。 因此，脲酶-博德比值法测定尿素操作简便，反应时间短，精密度和准确度较高。
3）酶电极法
它是一种基于脲酶水解尿素产生NH+4的酶促电导方法。 NH+4改变溶液的电导率，利用特定的电极测量电导率的变化来测定样品中的尿素含量。 比色分析在方法学上不使用，因此许多其他潜在干扰物质对测定的影响大大降低。 该方法反应时间仅为11.5秒，是目前测量尿素最快的方法。 维护方便，更适合现场快速检测分析。 2008年，尿素生物传感器研制成功临床。 将脲酶吸附在聚乙烯醇（PVA）和聚丙烯酰胺（PAA）的复合聚合物膜上，然后在V射线照射下诱导自由基聚合。 ，响应时间为120s，工作范围在1和1之间。虽然测量时间延长，但膜在含有二硫苏糖醇、U-巯基乙醇和甘油的磷酸盐缓冲溶液中可以保存三个月以上。 ，克服了以往酶电极使用寿命短的问题。
4）甲酚红法
应用甲酚红法测定尿素的主要原理是尿素在尿素酶的水解作用下产生氨，使溶液的pH值升高，引起甲酚红溶液的颜色发生相应的变化，从而半定量可以根据颜色是否变化及其深度来表征溶液。 尿素的存在和含量。 目前研究认为该方法具有简便、快速、灵敏等优点，可在样品快速测定中推广使用。 但该方法需要碱性环境显色，一般脲酶在酸性环境下才有活性。 在碱性条件下，脲酶活性不高甚至失活，因此该方法有一定的局限性。
5) 邻甲酚酞络合法
基于脲酶水解尿素后产生的氨改变溶液中氢离子浓度的原理，在一定的缓冲体系中，采用邻甲酚酞络合物比色定量溶液中氢离子浓度的变化。 使用邻甲酚酞复合物（OCPC）作为显色剂，在570nm波长处的吸光度变化与尿素浓度成正比。 该方法用于测定血清，操作简便，颜色稳定性好，线性范围为0.00-/L，检测限为0./L。 该方法灵敏、简单、准确，线性范围宽，适合自动分析。 但该方法与缓冲液的浓度有很大关系。 缓冲液浓度过高，灵敏度降低，低线性范围减小，同时也会影响反应体系的耐酸碱性能。
6) 甲基百里酚蓝法
脲酶水解尿素产生的氨增加了溶液的pH值。 pH值增加的幅度与尿素含量线性相关。 甲基百里酚蓝用作显色剂，检测溶液pH值的变化，从而推导出尿素含量。
7) ATP水解酶法
使用尿素氨基水解酶（ATP 水解酶）测量尿素浓度。 该方法的原理是尿素与ATP之间发生如下水解反应：
定量检出限可达5 μmol/L，检测灵敏度高。
3. 色谱法
色谱分析方法具有高速、高效、高灵敏度的特点。 它们适用于复杂混合物的分离并实现多种组分的同时测定。 广泛应用于环境监测、食品、农业等领域。 经查阅文献，尿素的色谱测定主要基于液相色谱相关技术。
1）高效液相色谱-荧光检测器法
最近，利用高效液相色谱法测量胸膜尿素的浓度，该色谱法将尿素与次溴酸在一定条件下反应产生的发光体与荧光检测器结合起来。 该方法临床上主要采用，但目前该方法并不准确。 一般线性相关系数r仅达到0.93，存在干扰，因此该方法需要进一步改进。
2) 液相色谱同位素稀释串联质谱法
以尿素同位素标记（Urea-13C、15N2）为内标，-SIL为色谱分离柱，乙腈溶液为流动相，电喷雾三重四极杆串联质谱多反应监测模式测定，支架为同位素稀释法用于量化。 在血清尿素的检测中，该方法的前处理操作简单、快速，不需要复杂的衍生化反应，定量准确，重复性高。 采用美国NIST血清标准物质进行验证，测定结果与标准值相对偏差小于0.5%，证明该方法准确度较高。
4. 中红外光谱
中红外光谱分析技术具有无需样品处理、成本低、样品消耗小、对样品进行无损检测等特点，适合分析各种状态的样品。 中红外光谱用于检测牛奶中的尿素。 利用牛奶中尿素的两个吸收峰的比值与牛奶中尿素浓度的关系来实现牛奶中尿素的定量分析。 虽然该方法的线性相关系数r可以达到0.96以上，但精度上仍存在较大缺陷。 但这为尿素的快速现场检测奠定了实验基础。
准备工作[2]
工业液氨与二氧化碳在180~200℃、15~20MPa条件下直接合成。 反应分为两步：首先生成氨基甲酸铵，然后脱水得到尿素。 反应式如下：
在实际生产中，这两个步骤都是在合成塔中连续进行的。 为了提高收率，氨的过量量为0.5～2倍。 反应(2)没有完全进行。 反应约1小时后，氨基甲酸铵的转化率仅为70%。 此时，合成塔内的物料除了尿素和水外，还包括未反应的物料氨基甲酸铵和过量的氨。 分离出未反应的物料，剩余的尿素水溶液进一步处理得到固体成品。 如果将未反应的物料一部分返回原合成系统循环利用，另一部分加工成其他氮肥，这种工艺路线称为“半循环法”，氨利用率为42%～73% 。 如果将未反应的物料全部返回合成系统循环利用，称为“全循环法”，氨利用率高达98%。 近年来，世界各国新建尿素装置大多采用全循环生产工艺。
主要参考资料
[1] 海洋化学词典
[2] 中国成人教育百科全书·化学·化工
[3]缓控释尿素研发综述
[4]尿素检测方法研究进展及快速检测产品现状